一种纯化萤火虫荧光素酶的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种纯化萤火虫荧光素酶的方法。
【背景技术】
[0002] 荧光素酶是生物体内催化荧光素或者脂肪醛氧化发光的一类酶的总称，可以从细 菌、萤火虫等生物中提取出来。萤火虫荧光素酶催化的发光反应必须要ATP和萤火虫荧光 素的参与。荧光素酶可以分为萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶两大类。由于荧光素酶检测 简便、灵敏、快速，因此目前荧光素酶基因在基因工程领域已经成为广泛使用的报告基因。 其内源性低，检测不易受到干扰，灵敏度高，检测范围广。萤火虫荧光素酶和细菌荧光素酶 可分别从萤火虫和发光细菌中直接提取，亦可用基因工程的方法进行生产。荧光素酶催化 的发光反应能用生物发光检测仪进行灵敏、快速检测，因此该酶有多方面的用途，如应用于 快速检测、报告基因分析、有毒有害物质分析等。
[0003] 荧光素酶发出的光的颜色主要取决于荧光素周围的氨基酸。在正常情况下它发出 黄绿光。但如果将其中的丝氨酸变为天冬氨酸(蛋白质编号2dlt)，则它会发出红光。
[0004] 荧光生成反应通常分为以下两步： 1 :荧光素 +ATP -荧光素化腺苷酸（Iuciferyladenylate) +PPi 2 :荧光素化腺苷酸+O2-氧荧光素+AMP+光 这一反应非常节省能量，几乎所有输入反应的能量都被转化为光。与之形成鲜明对比 的是人类使用的白炽灯，只有约10%的能量被转化为光，剩余的能量都变为热能而被浪费。
[0005] 荧光素酶可以在实验室中用基因工程的方法生成，并被用于多种不同的实验。荧 光素酶的基因可以被合成并插入到生物体中或转染到细胞中。研宄者利用基因工程已经使 得小鼠、家蚕、马铃薯等一些生物可以合成荧光素酶。间接体外成像是一种强大的研宄手 段，可以对整个动物体中的细胞群落进行分析。
[0006] 在荧光素酶中加入正确的荧光素底物就可以放出荧光，而发出的光子可以被光敏 感元件，如荧光探测器或改进后的光学显微镜探测到。这就使得对包括感染在内的多种生 命活动进程进行观察成为可能。例如，荧光素酶可以被用于检测血库中所存血液中的红血 球是否开始破裂。法医可以用含有荧光素酶的溶液来检测犯罪现场中残留的血迹。医院用 荧光素酶的发光来发现特定的疾病。荧光素酶还可以作为"报告蛋白"被用于分子生物学 研宄中，例如，用于在转染过荧光素酶的细胞中检测特定启动子的转录情况或用于探测细 胞内的ATP的水平；这一技术被称为报告基因检测法或荧光素酶检测法。荧光素酶是一个 热敏感蛋白，因此经常被用于研宄蛋白热变性过程中热休克蛋白的保护能力。
[0007] 基因组测序是当代生命科学技术的前沿核心技术之一，其中的焦磷酸测序法采用 了荧光素酶进行检测，读长大，精确度高。现有的荧光素酶纯化技术中，得到的产物纯度较 低，容易影响测序反应的精度，不能满足基因组测序的需要。
【发明内容】
[0008] 本发明的一个目的是一种纯化萤火虫荧光素酶的方法，包括以下步骤： (1) 加入金属盐：加入镁盐和钙盐； (2) 加入稳定剂； (3) 有机溶剂沉淀； (4) 无菌过滤； (5) 进行镍柱纯化； (6) 采用superdex 200进行分子排阻。
[0009] 所述镁盐为硫酸镁、氯化镁和硝酸镁中的一种或几种，所述钙盐为硫酸钙、氯化钙 和硝酸钾中的一种或几种。
[0010] 所述步骤（1)中加入镁盐和钙盐，使镁离子的终浓度为20-30mmol/l，钙离子的终 浓度为 l〇_20mmol/l。
[0011] 所述稳定剂为甘油、乙二醇、大豆多糖和二巯基苏糖醇中的一种或几种，优选为大 豆多糖和二巯基苏糖醇，稳定剂的终浓度为5-15g/L。
[0012] 所述有机溶剂沉淀使用的有机溶剂为甲醇、乙腈和丙酮中的一种或几种。
[0013] 所述无菌过滤使用0· 22 μ m滤膜。
[0014] 所述纯化方法的步骤中，保持荧光素酶的环境温度为16°C以下。
[0015] 所述荧光素酶带有His-tag。
[0016] 所述镍柱纯化时，使用20_500mM的咪唑进行梯度洗脱。
[0017] 所述superdex 200为GE分子排阻预装柱。
[0018] 本发明中加入的镁盐和钙盐能够增加荧光素酶的稳定性，同时保持其在纯化过程 中的高活性。稳定剂的加入进一步确保了荧光素酶的活性在纯化过程中不受损失。DEAE Sepharose CL-6B离子交换层析柱、superdex 200分子排阻和有机溶剂沉淀相结合，能够有 效去除酶液中的杂蛋白和其他杂质分子。使用本方法纯化得到的萤火虫荧光素酶活力大， 纯度高，催化效率高，能够确保反应精度，满足基因组测序的需要，适宜广泛应用于基因组 测序中。
【具体实施方式】
[0019] 实施例1 (1) 取IL焚光素酶粗酶液，加入氯化镁lOmmol、硫酸镁15mmol和氯化1? 16mmol ; (2) 加入大豆多糖6g和二巯基苏糖醇3g ; (3) 有机溶剂沉淀：缓慢加入15ml丙酮和20ml乙腈，搅拌，静置10分钟，13000rpm离 心，弃去上清，加入IOml Tris-HCl缓冲液，搅拌，13000rpm离心，收集上清液； (4) 使用0. 22 μ m滤膜进行无菌过滤； (5) 进行镍柱纯化，使用pH7. 4的Tris-HCl缓冲液进行柱平衡和洗脱，洗脱时使用 20-500mM的咪唑进行梯度洗脱； (6) 采用GE分子排阻预装柱superdex 200进行分子排阻，使用pH7. 4的Tris-HCl缓 冲液进行柱平衡和洗脱，得到酶液l〇〇ml，旋转蒸发干燥； 以上步骤均在16 °C环境下进行。
[0020] 实施例2 (1) 取IL焚光素酶粗酶液，加入硝酸镁20mmol、硫酸1? 12 mmol，氯化1? 8mmol ; (2) 加入甘油5g ; (3) 有机溶剂沉淀：缓慢加入20ml甲醇和12ml乙腈，搅拌，静置10分钟，13000rpm离 心，弃去上清，加入IOml Tris-HCl缓冲液，搅拌，13000rpm离心，收集上清液； (4) 使用0. 22 μ m滤膜进行无菌过滤； (5) 进行镍柱纯化，使用pH7. 4的Tris-HCl缓冲液进行柱平衡和洗脱，洗脱时使用 20-500mM的咪唑进行梯度洗脱； (6) 采用GE分子排阻预装柱superdex 200进行分子排阻，使用pH7. 4的Tris-HCl缓 冲液进行柱平衡和洗脱，得到酶液l〇〇ml，旋转蒸发干燥； 以上步骤（5)和（6)在4°C下进行，其他步骤均在16°C环境下进行。
[0021] 实施例3 (1) 取IL焚光素酶粗酶液，加入氯化镁30mmol、硫酸1? 2 mmol、氯化1? 4mmol和硝酸妈 4mmol ； (2) 加入甘油8g、乙二醇2g和大豆多糖5g ; (3) 有机溶剂沉淀：缓慢加入30ml乙腈，搅拌，静置10分钟，13000rpm离心，弃去上清， 加入IOml Tris-HCl缓冲液，搅拌，13000rpm离心，收集上清液； (4) 使用0. 22 μ m滤膜进行无菌过滤； (5) 进行镍柱纯化，使用pH7. 4的Tris-HCl缓冲液进行柱平衡和洗脱，洗脱时使用 20-500mM咪唑进行梯度洗脱； (6) 采用GE分子排阻预装柱superdex 200进行分子排阻，使用pH7. 4的Tris-HCl缓 冲液进行柱平衡和洗脱，得到酶液l〇〇ml，旋转蒸发干燥； 以上步骤（5)和（6)在4°C下进行，其他步骤均在16°C环境下进行。
[0022] 实施例4 (1) 取IL焚光素酶粗酶液，加入硫酸镁28mmol、氯化1? 5mmol和硝酸1? 6mmol ; (2) 加入甘油6g、乙二醇5g、大豆多糖Ig和二巯基苏糖醇I. 5g ; (3) 有机溶剂沉淀：缓慢加入IOml乙腈、IOml丙酮和16ml甲醇，搅拌，静置10分钟， 13000rpm离心，弃去上清，加入IOml Tris-HCl缓冲液，搅拌，13000rpm离心，收集上清液； (4) 使用0. 22 μ m滤膜进行无菌过滤； (5) 进行镍柱纯化，使用pH7. 4的Tris-HCl缓冲液进行柱平衡和洗脱，洗脱时使用 20-500mM咪唑进行梯度洗脱； (6) 采用GE分子排阻预装柱superdex 200进行分子排阻，使用pH7. 4的Tris-HCl缓 冲液进行柱平衡和洗脱，得到酶液l〇〇ml，蒸发干燥； 以上步骤均在16 °C环境下进行。
[0023] 对比例1 (1) 取IL荧光素酶粗酶液，加入硫酸镁3mmol和氯化钙5mmol ; (2) 加入甘油Ig ; (3) 有机溶剂沉淀：缓慢加入6ml甲醇，搅拌，13000rpm离心，弃去上清，加入IOml Tris-HCl缓冲液，搅拌，13000rpm离心，收集上清液； (4) 使用0. 22 μ m滤膜进行无菌过滤； (5)进行镍柱纯化，使用pH6. 5的Tris-HCl缓冲液进行柱平衡和洗脱，洗脱时使用 20-500mM咪唑进行梯度洗脱，干燥； 以上步骤均在26°C环境下进行。
[0024] 对实施例1、实施例2和对比例1进行产物酶纯度的测定，结果如下：
表1 由表1可知，本发明中得到的产物纯度显著高于对比例1，达到了 98. 62%，而由不同条 件得到的对比例1产物纯度仅为95. 36%。高纯度的荧光素酶能够确保测序反应的顺利进 行。
[0025] 上述详细说明是针对本发明其中之一可行实施例的具体说明，该实施例并非用以 限制本发明的专利范围，凡未脱离本发明所为的等效实施或变更，均应包含于本发明技术 方案的范围内。
【主权项】
1. 一种纯化萤火虫荧光素酶的方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 加入金属盐：加入镁盐和钙盐； (2) 加入稳定剂； (3) 有机溶剂沉淀； (4) 无菌过滤； (5) 进行镍柱纯化； (6) 采用superdex 200进行分子排阻。2. 如权利要求1所述的纯化萤火虫荧光素酶的方法，其特征在于，所述镁盐为硫酸镁、 氯化镁和硝酸镁中的一种或几种，所述钙盐为硫酸钙、氯化钙和硝酸钾中的一种或几种。3. 如权利要求1所述的纯化萤火虫荧光素酶的方法，其特征在于，所述步骤（1)中加入 镁盐和妈盐，使镁离子的终浓度为20-30_〇1/1，妈离子的终浓度为10-20_〇1/1。4. 如权利要求1所述的纯化萤火虫荧光素酶的方法，其特征在于，所述稳定剂为甘油、 乙二醇、大豆多糖和二巯基苏糖醇中的一种或几种，优选为大豆多糖和二巯基苏糖醇。5. 如权利要求1所述的纯化萤火虫荧光素酶的方法，其特征在于，所述有机溶剂沉淀 使用的有机溶剂为甲醇、乙腈和丙酮中的一种或几种。6. 如权利要求1所述的纯化萤火虫荧光素酶的方法，其特征在于，所述无菌过滤使用 0? 22 ym 滤膜。7. 如权利要求1所述的纯化萤火虫荧光素酶的方法，其特征在于，所述纯化方法的步 骤中，保持荧光素酶的环境温度为16°C以下。
【专利摘要】本发明属于生物技术领域，具体涉及一种纯化萤火虫荧光素酶的方法。包括以下步骤：加入金属盐和稳定剂，进行有机溶剂沉淀，过滤，采用镍柱和分子筛。本方法设计合理，使用本方法纯化得到的萤火虫荧光素酶活力大，催化效率高，能够广泛应用于基因组测序中。
【IPC分类】C12N9/02
【公开号】CN104946607
【申请号】CN201510414398
【发明人】高静, 蔡亦梅, 徐潇, 吴超, 张睿, 王者馥, 王绪敏, 殷金龙, 任鲁风
【申请人】北京中科紫鑫科技有限责任公司
【公开日】2015年9月30日
【申请日】2015年7月15日