一种采用超滤法辅助硫酸铵盐析提取乳过氧化物酶的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种提取乳过氧化物酶的方法，特别涉及一种采用超滤法辅助硫酸铵 盐析提取乳过氧化物酶的方法，本发明属于乳过氧化物酶的提取制备技术领域。
【背景技术】
[0002] 乳过氧化物酶（lactoperoxidase，以下简称LP)是动物乳中分泌的一种氧化还原 酶，并在保护哺乳期乳腺和预防新生婴儿的肠道病原微生物扮演着一个重要的角色，LP能 够催化内源的硫氰酸盐（SCN-)氧化成具有抗菌性的硫氰酸盐（0SCN-)。牛乳中存在的乳 过氧化物酶，它能够使卤化物氧化或在过氧化氢存在下氧化硫氰酸盐而形成抗菌介质。乳 过氧化物酶携带Fe3+_血红素蛋白，它存在于哺乳动物生物液体，如牛奶，唾液和眼泪中。 LP分子量为85kDa，等电点为8. 0-8. 5,在pH值为6. 5时LP带正点，其在乳清中的含量为 10-30mg/L〇
[0003] 乳过氧化物酶体系在食品行业中应用最广泛的是乳制品，在过去几十年里国内外 有大量从乳中提取LP的方法有色谱技术、膜色谱等，色谱技术应用有离子交换，分子筛，免 疫亲和色谱，膜色谱应用较多的是离子交换吸附膜。虽然传统这些色谱法提取LP纯度较 高，但是仍有很多缺点例如耗时较长，回收率较低及成本昂贵，并不适宜大量生产乳过氧化 物酶。想要高效率的从牛乳清中提取LP并不是一个简单的任务，因为乳清中存在大量的杂 蛋白给分离带来了困难，因此从乳清中分离LP迫切的需要一个效率高、成本低、开发潜力 大的方法。
[0004] 盐析沉淀法是酶分离纯化过程中最常用的方法，其原理是在高浓度的盐溶液中， 大量盐离子使水浓度相对降低，蛋白质水化作用减弱，相互凝聚沉淀出来，由于蛋白质水化 作用与蛋白质本身的分子量、等电点等物化常数有关，所以不同蛋白质在不同盐析条件下 的析出程度也不同，从而达到分离目的。盐析法具有成本低、不需要昂贵设备、操作简单安 全等特点，适用范围十分广泛。国内有关于用硫酸盐析法分离大豆酸沉蛋白和羔羊皱胃酶 的报道，但是还没有报道用其分离乳过氧化物酶的。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于克服上述现有技术缺陷，提供一种可以用于工业化生产高回收 率和纯化倍数可用于食品工业的乳过氧化物酶提取方法。
[0006] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
[0007] 以牛乳清为原料，以硫酸铵盐析法为提取手段，确定硫酸铵盐析法中最佳盐析条 件下饱和度、盐析时间、最佳转速、体系pH的工艺条件，并比较了硫酸铵盐分级沉淀与直接 一次用65%硫酸铵饱和度对LP酶活回收率和纯化倍数的影响。采用超滤技术进行进一步 纯化，最后透析脱盐和冷冻干燥制得成品，即原料乳清一硫酸铵盐析法分级沉淀提取乳过 氧化酶一沉淀溶解一溶液使用超滤分离一收集截留溶液一透析脱盐一冷冻干燥一乳过氧 化物酶粗产品。
[0008] 具体的，本发明的一种采用超滤法辅助硫酸铵盐析提取乳过氧化物酶的方法，包 含以下步骤：
[0009] (1)硫酸铵盐析法分级提取乳过氧化物酶：
[0010] 除去新鲜的牛乳中的脂肪和酪蛋白后得到乳清，在室温条件下，向乳清中添加 25-85%饱和度的硫酸铵，离心，去除沉淀，置于搅拌器上不断搅拌使硫酸铵充分溶解，调节 体系pH到5. 5-8. 5,放置2-10h使乳过氧化物酶完全沉淀，4°C5000-10000r/min离心20min 到沉淀即为乳过氧化物酶制品；
[0011] ⑵超滤：
[0012] 将步骤（1)中得到的沉淀使用适量去离子水复溶用超滤膜进行超滤分离，以除去 杂蛋白，收集截留溶液；
[0013] (3)脱盐处理：
[0014] 将步骤（2)收集的截留溶液装入透析袋内进行脱盐；
[0015] (4)干燥：
[0016] 将步骤（3)脱盐溶液冷冻干燥即制得乳过氧化物酶粗制品。
[0017] 在本发明中，优选的，所述步骤（1)中使用硫酸铵饱和度为65%。
[0018] 在本发明中，优选的，所述步骤（1)中使用硫酸铵分级沉淀盐析，具体为使用先 用饱和度25-35%的硫酸铵盐析，离心，去除沉淀，上清液中继续加硫酸铵至终饱和度为 55-70 %〇
[0019] 在本发明中，优选的，所述步骤（1)中使用先用饱和度30%的硫酸铵盐析，离心， 去除沉淀，上清液中继续加硫酸铵至终饱和度为65%。
[0020] 在本发明中，优选的，所述步骤（1)中离心转速使用7000r/min。
[0021] 在本发明中，优选的，所述步骤（1)中硫酸铵盐析时间为8h。
[0022]在本发明中，优选的，所述步骤（1)盐析体系pH为6. 5。
[0023] 在本发明中，优选的，所述步骤（2)中使用分子量30_50kDa的超滤膜进行超滤分 离，以除去部分分子量小于30_50kDa的杂蛋白，收集截留溶液，进而达到浓缩纯化乳过氧 化物酶的目的。
[0024] 在本发明中，优选的，所述步骤（2)中超滤所使用的超滤膜的分子量为30kDa。
[0025] 在本发明中，优选的，所述步骤（3)中将步骤（2)收集的截留溶液装入分子量 2-14kDa透析袋内进行脱盐，每隔l-2h更换一次去离子水，透析3-4h即可。
[0026] 本发明与现有技术不同之处在于本发明取得了如下技术效果：
[0027] 采用本发明提取的乳过氧化物酶粗产品为淡黄色粉状物，乳过氧化物酶的酶活回 收率和纯化倍数分别达到79. 25-85. 21 %和4. 08-4. 58倍。
[0028] 通过上述提取工艺可以直接获得回收率较高的乳过氧化物酶，可以直接制得天然 的抗菌介质乳过氧化物酶制品，也可以将其制品作为天然防腐剂直接加入到食品中。
[0029] 通过上述提取方法可以直接获得回收率较高的乳过氧化物酶，可以直接制得天然 的抗菌介质乳过氧化物酶制品，也可以将其制品作为天然防腐剂直接加入到食品和牙膏等 曰用品中。
[0030] 下面结合附图对本发明作进一步说明。
【附图说明】
[0031] 图1为SDS-PAGE电泳图谱分析；
[0032] 注：泳道M为标准物质Marker图谱，泳道1为乳清样品，泳道2为二步盐析后所得 的乳过氧化物酶，泳道3为二步盐析并经过30kDa分子量超滤膜后的乳过氧化物酶；图谱左 侧的一列数字代表Marker的分子量（单位：kD);
[0033] 图2为不同饱和度硫酸铵对LP分离效果的影响；
[0034] 注：同一曲线标注无相同字母者差异显著（p〈0. 05);
[0035] 图3为转速对LP酶活回收率和纯化倍数的影响；
[0036] 注：同一曲线标注无相同字母者差异显著（p〈0. 05);
[0037] 图4为盐析时间对LP酶活回收率和纯化倍数的影响；
[0038] 注：同一曲线标注无相同字母者差异显著（p〈0. 05);
[0039] 图5为盐析体系pH对LP酶活回收率和纯化倍数的影响；
[0040] 注：同一曲线标注无相同字母者差异显著（p〈〇. 05);
[0041] 图6硫酸铵盐分级沉淀LP酶活回收率和纯化倍数的影响；
[0042] 注：同一曲线标注无相同字母者差异显著（p〈0. 05)。
【具体实施方式】
[0043] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员 应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行 修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
[0044] 实施例1乳过氧化物酶的提取
[0045] (1)硫酸铵盐析法提取乳过氧化物酶：
[0046] 除去新鲜的牛乳中的脂肪和酪蛋白后得到乳清，在室温条件下，向乳清中先添加 30%饱和度硫酸铵，离心，去除沉淀，上清液中继续加硫酸铵至终饱和度为65 %，置于搅拌 器上不断搅拌使硫酸铵充分溶解，调节体系pH到6. 5,放置8h使乳过氧化物酶完全沉淀， 4°C7000r/min离心20min到沉淀即为乳过氧化物酶制品，并计算其酶活回收率和纯化倍 数；
[0047] (2)超滤：将步骤（1)中得到的沉淀进行溶解，溶解后得到的溶液置于分子量 30kDa的超滤膜，进行超滤分离，除去部分分子量小于30kDa的杂蛋白，收集超滤膜所得的 截留溶液，进而达到浓缩纯化乳过氧化物酶的目的；
[0048] (3)脱盐处理：将上述截留溶液装入分子量10kDa透析袋内进行脱盐，每隔l_2h 更换一次去离子水，透析3_4h;
[0049] (4)干燥：
[0050] 将脱盐溶液冷冻干燥即制得乳过氧化物酶粗制品。
[0051] 结果验证：
[0052] 1、SDS-PAGE电泳图谱分析：
[0053] 蛋白标准品、牛乳清、二步盐析后所得的乳过氧化物酶和二步盐析并超滤后所得 的乳过氧化物酶的SDS-PAGE图谱见图1，由图1可以看出牛乳清所在泳道处有很多条带，即 含有多种蛋白质成分；硫酸铵盐析结合超滤分离后的电泳条带明显减少，所获得的条带接 近报道的LP分子量为85kDa左右，这表明本发明的一种采用超滤法辅助硫酸铵盐析提取乳 过氧化物酶的方法是分离乳过氧化物酶的有效方法。
[0054] 2、乳过氧化酶的酶活测定
[0055] 取3mL浓度为lmmol/L的ABTS(溶于0.lmol/LpH6. 0的磷酸盐缓冲溶液）至反应 试管中，然后加入〇.lmL的浓度为3. 2mmol/L的H202，再加入适当稀释的反应酶液0.lmL(用 0.lmol/LpH6. 0的磷酸盐缓冲溶液稀释），充分混合后，开始计时，反应2min后立即测定 吸光度值，在波长为412nm处，以ABTS和适当稀释酶液的混合液为空白对照组（在室温条 件下）。LP的酶活力单位是U/mL，公式为：
[0056]酶活力=A A412XVXS/e XV1XDX2
[0057] 式中AA412为2min吸光度的变化，V为反应液的总体积，S为样品酶液的稀释倍 数，VI是样品酶液的添加体积，D是光路径为lcm，2代表时间是2min，e= 32. 4mmol/L、 cmx〇
[0058] 3、乳过氧化物酶的酶活性回收率和纯化倍数的计算
[0060] 式中AR为LP的酶活回收率，Ls和Li分别代表盐相溶液和乳清中LP酶活，Vs和 Vi分别代表盐相溶液体积和乳清体积。
[0061] 结果表明采用本发明方法提取得到的乳过氧化物酶粗产品为乳白色粉状物，乳过 氧化物