酶的酶活回收率达到85. 21%。
[0063] 式中PF为纯化倍数，Ls和Li分别代表盐相溶液和乳清中LP酶活，Ps和Pi分别 代表盐相溶液和乳清中蛋白浓度。
[0064] 结果表明采用本发明方法提取得到的乳过氧化物酶粗产品为乳白色粉状物，乳过 氧化物酶酶的纯化倍数达到4. 08倍。
[0065] 实施例2乳过氧化物酶的提取
[0066] (1)硫酸铵盐析法提取乳过氧化物酶：
[0067] 除去新鲜的牛乳中的脂肪和酪蛋白后得到乳清，在室温条件下，向乳清中先添加 25%饱和度硫酸铵，离心，去除沉淀，上清液中继续加硫酸铵至终饱和度为60 %，置于搅拌 器上不断搅拌使硫酸铵充分溶解，调节体系pH到6. 0,放置6h使乳过氧化物酶完全沉淀， 4°C8000r/min离心20min到沉淀即为乳过氧化物酶制品，并测定其酶活回收率和纯化倍 数；
[0068] (2)超滤：将步骤（1)中得到的沉淀进行溶解，溶解后得到的溶液置于分子量 50kDa的超滤膜，进行超滤分离，除去部分分子量小于30kDa的杂蛋白，收集超滤膜所得的 截留溶液，进而达到浓缩纯化乳过氧化物酶的目的；
[0069] (3)脱盐处理：将上述截留溶液装入分子量5kDa透析袋内进行脱盐，每隔l_2h更 换一次去离子水；
[0070] (4)干燥：
[0071] 将脱盐溶液冷冻干燥即制得乳过氧化物酶粗制品。
[0072] 试验例1硫酸铵饱和度对LP酶活回收率和纯化倍数的影响
[0073] 添加硫酸铵饱和度在25-85%之间，研宄不同饱和度硫酸铵对LP分离效果，具体 结果见图2,其余步骤同实施例1，酶活回收率和纯化倍数的的具体计算公式如实施例1所 述。
[0074] 由图2可以看出硫酸铵饱和度在25% -30%时，其沉淀中几乎不含LP，随着其饱 和度的逐渐增加，LP酶活回收率和纯化倍数也逐渐增加，当硫酸铵饱和度在35% -50% 之间时，LP盐析沉淀很少，当硫酸铵饱和度为60% -65 %时其酶活回收率最大，达到 81. 84% -84. 15%，与其他饱和度条件差异显著（P〈0. 05)，当硫酸铵饱和度为65%时，LP的 纯化倍数达到最大，与其他饱和度条件差异显著（P〈〇. 05)，但当其饱和度超过65%时，LP 酶活回收率和纯化倍数开始下降，尤其是LP的纯化倍数下降趋势很明显，这是因为随着硫 酸铵饱和度的进一步增加，乳清中的大部分杂蛋白均被盐析沉淀，从而使LP的纯化倍数下 降明显。结合LP酶活回收率和纯化倍数的综合影响，当硫酸铵饱和度65%时对LP纯化效 果最佳。
[0075] 试验例2转速对LP酶活回收率和纯化倍数的影响
[0076] 在不同转速大小的情况下，盐析沉淀乳清中杂蛋白的情况不同，研宄不同转速大 小对LP分离纯化的影响，结果见图3所示，其余步骤同实施例1，酶活回收率和纯化倍数的 的具体计算公式如实施例1所述。
[0077] 由图3可以看出在转速5000r/min时LP明显没被完全离心沉淀下来，随着转速的 增加，LP的酶活回收率和纯化倍数增加，其中当转速达到7000r/min时，LP酶活回收率和纯 化倍数都达到最高，当转速进一步增加，酶活回收率基本保持不变（P〈〇. 05)，但LP纯化倍 数随着转速增加而减小，这可能因为在大的离心力条件下大部分乳清中的杂蛋白均沉淀下 来，进而减小了LP的纯化倍数，而小的离心力条件下LP又未能完全沉淀，所以纯化倍数也 相对较低，转速7000r/min时LP刚好全部沉淀下来，当转速7000r/min时LP酶活回收率和 纯化倍数条件最优，故离心时转速选择7〇〇〇r/min。
[0078] 试验例3盐析时间对LP酶活回收率和纯化倍数的影响
[0079] 盐析时间是影响LP盐析效果的一个重要因素，通常一种酶的盐析是需要一定的 盐析时间才能完成的，研宄不同盐析时间对LP分离纯化的影响，结果见图4所示，酶活回收 率和纯化倍数的的具体计算公式如实施例1所述。
[0080] 由图4可知，盐析时间由2h增加到10h，LP的酶活回收率在8h时最高，低于8h或 高于8h回收率均有所降低，这是因为当低于8h时，LP不能够完全的盐析，而盐析时间过长， 达到10h时将影响LP酶活，使回收率有所降低。随着盐析时间的增加，LP的纯化倍数也有 所下降，这可能因为随着盐析时间的增加乳清中的杂蛋白也逐渐沉淀析出，但盐析时间8h 时，这个时间点LP大量沉淀，故盐析在8h时LP纯化倍数也较高。
[0081] 试验例4体系pH对LP酶活回收率和纯化倍数的影响
[0082] pH是对LP活性具有一定的重要影响，因此也将是影响盐析效果的一个重要的条 件，结果见图5所示，酶活回收率和纯化倍数的的具体计算公式如实施例1所述。
[0083] 由图5可以看出，当pH为6.5时LP酶活回收率和纯化倍数达到最高，分别为 88. 69%和2. 56倍，与其他pH值盐析效果差异显著（P〈0. 05)，pH低于或高于6. 5时LP的 回收率和纯化倍数均下降，这可能是因为pH6. 5最有利于LP的酶活，当pH过高或过低时LP的酶活受到影响，所以当pH为6. 5时盐析效果最佳。
[0084] 试验例5硫酸铵盐分级沉淀LP酶活回收率和纯化倍数的影响
[0085] 硫酸铵盐分级沉淀是先用30%饱和度硫酸铵盐盐析，离心去除沉淀，上清液再用 65%饱和度硫酸铵盐盐析，结果如图6所示，酶活回收率和纯化倍数的的具体计算公式如 实施例1所述。
[0086] 由图6可以看出，二步盐析法与一步盐析法效果相比，LP酶活回收率差异不显著 (P>0. 05)，即LP在此过程中损失较小，这也与图2中30%饱和度硫酸铵盐不能盐析出LP结 果一致，故损失可忽略不计，二步盐析在处理过程中去除了一些杂蛋白，纯化倍数增加显著 (P〈0. 05)，纯化倍数由2. 56倍增加到3. 13,从而得到二步盐析法效果较佳。
[0087] 试验例6超滤法对LP酶活回收率和纯化倍数的影响
[0088] 使用超滤膜对硫酸铵盐析提取出的LP进一步纯化处理，研宄超滤对LP酶活回收 率和纯化倍数的影响，其余步骤同实施例1，酶活回收率和纯化倍数的具体计算公式如实施 例1所述。
[0089] 试验结果如下表1所示：
[0091] 注：表中同行字母相同代表差异不显著（P>〇. 05)，不相同代表差异显著 (P〈0. 05) 〇
[0092] 由表1所示，使用分子量30kDa和50kDa的超滤膜使盐析沉淀所得LP的纯化倍数 由3. 13分别增加至4. 08和4. 58倍（P〈0. 05)，这说明了使用超滤膜分离起到了过滤一些小 的杂蛋白的作用，从而使纯化倍数有了显著的提高；而分子量50kDa的超滤膜虽然在纯化 倍数上高于分子量30kDa的超滤膜，但在超滤时造成LP少量的损失使得其酶活回收率造成 损失较大，分子量30kDa的超滤膜在超滤时保证了LP都保留在截留液中，并过滤了较多的 杂蛋白，得到了较高的纯化倍数，在首要考虑回收率的情况下，故使用30kDa分子量的超滤 膜较合适。
【主权项】
1. 一种采用超滤法辅助硫酸铵盐析提取乳过氧化物酶的方法，其特征在于包含以下步 骤： (1) 硫酸铵盐析法分级提取乳过氧化物酶： 除去新鲜的牛乳中的脂肪和酪蛋白后得到乳清，在室温条件下，向乳清中添加25-85% 饱和度的硫酸铵，离心，去除沉淀，置于搅拌器上不断搅拌使硫酸铵充分溶解，调节体系PH 到5. 5-8. 5,放置2-10h使乳过氧化物酶完全沉淀，4°C 5000-10000r/min离心20min到沉淀 即为乳过氧化物酶制品； (2) 超滤： 将步骤（1)中得到的沉淀使用适量去离子水复溶用超滤膜进行超滤分离，以除去杂蛋 白，收集截留溶液； (3) 脱盐处理： 将步骤（2)收集的截留溶液装入透析袋内进行脱盐； (4) 干燥： 将步骤（3)脱盐溶液冷冻干燥即制得乳过氧化物酶粗制品。2. 根据权利要求1所述的采用超滤法辅助硫酸铵盐析提取乳过氧化物酶的方法，其特 征在于：所述步骤（1)中使用硫酸铵饱和度为65%。3. 根据权利要求1所述的采用超滤法辅助硫酸铵盐析提取乳过氧化物酶的方法，其特 征在于：所述步骤（1)中使用硫酸铵分级沉淀盐析，具体为使用先用饱和度25-35%的硫酸 铵盐析，离心，去除沉淀，上清液中继续加硫酸铵至终饱和度为55-70%。4. 如权利要求3所述的采用超滤法辅助硫酸铵盐析提取乳过氧化物酶的方法，其特征 在于：所述步骤（1)中使用先用饱和度30%的硫酸铵盐析，离心，去除沉淀，上清液中继续 加硫酸按至终饱和度为65%。5. 如权利要求1所述的采用超滤法辅助硫酸铵盐析提取乳过氧化物酶的方法，其特征 在于：所述步骤（1)中离心转速使用7000r/min。6. 如权利要求1所述的采用超滤法辅助硫酸铵盐析提取乳过氧化物酶的方法，其特征 在于：所述步骤（1)中硫酸铵盐析时间为8h。7. 如权利要求1所述的采用超滤法辅助硫酸铵盐析提取乳过氧化物酶的方法，其特征 在于：所述步骤⑴盐析体系PH为6. 5。8. 如权利要求1所述的采用超滤法辅助硫酸铵盐析提取乳过氧化物酶的方法，其特征 在于：所述步骤（2)中使用分子量30-50kDa的超滤膜进行超滤分离，以除去部分分子量小 于30-50kDa的杂蛋白，收集截留溶液，进而达到浓缩纯化乳过氧化物酶的目的。9. 如权利要求8所述的采用超滤法辅助硫酸铵盐析提取乳过氧化物酶的方法，其特征 在于：所述步骤（2)中超滤所使用的超滤膜的分子量为30kDa。10. 如权利要求1所述的采用超滤法辅助硫酸铵盐析提取乳过氧化物酶的方法，其特 征在于：所述步骤（3)中将步骤（2)收集的截留溶液装入分子量2-14kDa透析袋内进行脱 盐，每隔1-2h更换一次去离子水，透析3-4h即可。
【专利摘要】本发明公开了一种采用超滤法辅助硫酸铵盐析提取乳过氧化物酶的方法，以牛乳清为原料,采用硫酸铵盐析方法分离牛乳清中乳过氧化物酶，具体方法为向乳清中添加一定饱和度的硫酸铵，经过一段时间使乳过氧化物酶沉淀，离心使乳过氧化物酶完全沉淀，收集沉淀即获得乳过氧化物酶，将沉淀复溶，经超滤膜去除小的杂蛋白，进一步纯化乳过氧化物酶，通过透析袋脱盐处理，然后冷冻干燥，从而制备出高活性的可用于天然食品添加剂的乳过氧化物酶产品。采用本发明可以直接制得天然的抗菌介质乳过氧化物酶制品，也可以将其作为天然防腐剂直接加入到食品或牙膏等日常用品中。
【IPC分类】C12N9/08
【公开号】CN104962531
【申请号】CN201510367541
【发明人】姜瞻梅, 许晓曦, 刘丽丽, 辛岩
【申请人】东北农业大学
【公开日】2015年10月7日
【申请日】2015年6月29日