个阅读，获得大约25bp_250bp的序列数 据。
[0087] 如前所述，对数据进行生物信息学分析。例如，使用FASTX-Toolkit消除重复阅 读。然后准确如前所述，使用Bowtie2软件对数据进行匹配分析，以制备独特匹配到所述参 考基因组的非严格性片段长度。还排除了拷贝数变异。
[0088] 对于四份母体血浆DNA样品，即两份正常（N1和N2)和两份三体性21怀孕（T21/1 和T21/2)，作图的阅读数量和它们的染色体位置见表2 : 表2
然后对于四份母体血浆DNA样品，即两份正常（N1和N2)和两份三体性21怀孕（T21/1 和T21/2)，将表2中的数据标准化到"每一百万良好命中"基础，见表3 : 表3
注意，表2和3中所示的4份母体样品来自其中胎儿被证实为男性的怀孕（在采集这 些数据的血浆样品之后）。根据表2和3的数据，依照本发明的第二方面，该结果能够被容 易地预测。
[0089] 为了依照本发明检测三体性21，对于每个样品，计算染色体21命中相对于在其它 常染色体上的总命中的比例。
[0090]N1、N2、T21/1 和T21/2 的值见表 4 : 表4:染色体21命中相对于其它常染色体的命中的比例
两个三体性21病例的失调分别是1. 0846和1. 0462,并因此符合其中胎儿DNA部分介 于5%和15%之间的三体性21样品。
[0091] 使用扩展的数据集来确定标准差的值，所测4份样品的z-分值分别为：_0. 16 和-0. 29 (对于两个正常病例）和5. 50和2. 55 (对于两个三体性21病例），表明这两个三 体性21病例以大约99%概率或更高被检出。
[0092] 在来自正常怀孕（样品1-15)和来自三体性21怀孕（样品16-27)的27份血浆 样品上进行类似程序，z-分值结果见表5并描绘于图2,其中可见z-分值的范围对于12个 三体性21病例为4. 59至17. 86,对于15个正常病例为2. 09至-1. 31。表5还显示染色体 21相对于其它染色体的百分率的差异，其中对于12个三体性21病例可见较高百分率。
[0093] 表5:在正常和三体性21样品中的染色体21的Z-分值和％比例
在本文的实施例1、表5和图2中所示的数据证明本发明的方法用于在血浆DNA样品中 准确地和非侵入性地诊断三体性21的清楚的能力。
【主权项】
1. 在得自女性受试者的生物样品中检测胎儿染色体异常的方法，所述方法包括以下 步骤： (a) 获得在所述生物样品内的核酸分子的序列数据； (b) 在所述序列数据内的每个核酸序列和对应于参考基因组的独特部分的序列之间 进行匹配分析，使得每个匹配的核酸被指定到所述参考基因组内的特定染色体或所述染色 体的一部分，其中所述匹配分析对于对应于所述参考基因组中的碱基的每个核酸内的每个 碱基产生准确率分值并对于任何插入、缺失、模糊和/或取代产生罚分，使得如果每个核酸 的总分值达到预定分值阈值，则匹配被指定；和 (c) 测定指定到靶染色体的匹配的核酸总数相对于指定到一个或多个参考染色体的 每个的匹配的核酸总数的比例； 其中相对于正常怀孕中的比例，所测比例中的统计显著差异，表明靶染色体中的胎儿 异常。2. 权利要求1的方法，其中所述靶染色体是染色体13、染色体18、染色体21、X染色体 或Y染色体。3. 权利要求1或2的方法，其中所述胎儿染色体异常是胎儿染色体非整倍性。4. 权利要求3的方法，其中所述胎儿染色体非整倍性是三体性13、三体性18或三体性 21〇5. 权利要求4的方法，其中所述胎儿染色体非整倍性是三体性21 (唐氏综合征）。6. 在怀孕的女性受试者中预测胎儿性别的方法，所述方法包括以下步骤： (a) 自所述怀孕的女性受试者中获得生物样品； (b) 获得在所述生物样品内的核酸分子的序列数据； (c) 在所述序列数据内的每个核酸序列和对应于参考基因组的独特部分的序列之间 进行匹配分析，使得每个匹配的核酸被指定到所述参考基因组内的特定染色体或所述染色 体的一部分，其中所述匹配分析对于对应于所述参考基因组中的碱基的每个核酸内的每个 碱基产生准确率分值并对于任何插入、缺失、模糊和/或取代产生罚分，使得如果每个核酸 的总分值达到预定分值阈值，则匹配被指定；和 (d) 测定指定到Y染色体的匹配的核酸总数相对于指定到一个或多个参考染色体的 每个的匹配的核酸总数的比例； 其中高于预定比例的匹配的Y染色体序列的存在表明存在男性胎儿，而低于预定比例 的匹配的Y染色体序列的存在表明存在女性胎儿。7. 权利要求1-6中任一项的方法，其中通过Bowtie2或BWA-SW软件或使用最大准确 匹配技术的软件例如BWA-MEM或CUSHAW2软件，进行所述匹配分析。8. 权利要求1-7中任一项的方法，其中所述匹配分析包括将核酸匹配到所述参考基 因组内的所述染色体的预定部分的步骤。9. 权利要求1-8中任一项的方法，其中所述准确率分值是正分。10. 权利要求9的方法，其中对于对应于所述参考基因组中的碱基的核酸内的每个碱 基，所述正分为+2。11. 权利要求1-10中任一项的方法，其中对于任何插入、缺失、模糊和/或取代的罚分 是减少的分值，例如负分。12. 权利要求11的方法，其中对于取代的负分是-6,对于模糊的负分是-1，对于插入 或缺失的负分是-5加上对于插入或缺失内的每个残基的_3。13. 权利要求1-12中任一项的方法，其中最小分值阈值是由下式定义： a+b*ln (L) 其中a和b是指确定用于优化匹配准确率的评分参数，In是指阅读长度（L)的自然对 数。14. 权利要求13的方法，其中a代表20, b代表8. 0。15. 权利要求1-14中任一项的方法，其中所分析的核酸序列包含大约25bp至大约 250bp〇16. 权利要求1-15中任一项的方法，其中所述生物样品是母体的血液、血浆、血清、尿 或唾液。17. 权利要求16的方法，其中所述生物样品是母体血浆。18. 权利要求1-17中任一项的方法，其额外地包括在匹配分析步骤之前从所得的序 列数据中消除重复阅读的步骤。19. 权利要求1-18中任一项的方法，其额外地包括根据样品内的胎儿DNA的量来标准 化或调整匹配命中数的步骤。20. 权利要求1-19中任一项的方法，其中所述序列数据通过下一代测序平台而获得。21. 权利要求1-20中任一项的方法，其中所述序列数据通过测序平台而获得，其包括 使用聚合酶链式反应。22. 权利要求1-20中任一项的方法，其中所述序列数据通过测序平台而获得，其包括 使用通过合成的测序。23. 权利要求1-20中任一项的方法，其中所述序列数据通过测序平台而获得，其包括 使用离子例如氢离子的释放。24. 权利要求1-20中任一项的方法，其中所述序列数据得自测序平台，其包括使用基 于半导体的测序方法学。25. 权利要求1-20中任一项的方法，其中所述序列数据得自测序平台，其包括使用基 于纳米孔的测序方法学。26. 权利要求25的方法，其中所述基于纳米孔的方法学包括使用有机型纳米孔。27. 权利要求25或26的方法，其中所述基于纳米孔的方法学包括使用由金属、聚合物 或塑料材料构建的纳米孔。28. 权利要求27的方法，其中所述下一代测序平台选自：Roche 454 (即Roche 454 GS FLX)、Applied Biosystems' SOLiD 系统（即 S0LiDv4)、Illumina' s GAIIx、HiSeq 2000 和 MiSeq 测序仪、Life Technologies' Ion Torrent 半导体测序平台、Pacific Biosciences' PacBio RS 和 Sanger' s 3730x1。29. 权利要求1-20中任一项的方法，其中所述序列数据通过Life Technologies' Ion Torrent 平台或 Illumina' s MiSeq 而获得。30. 权利要求29的方法，其中所述序列数据通过Life Technologies' Ion Torrent Personal Genome Machine (Ion Torrent PGM)而获得。31.权利要求30的方法，其中所述序列数据通过基于Life Technologies' Ion Torrent平台和其进一步的衍生装置及组件的多元能力迭代而获得，所述平台例如带有PI 或 PII 芯片的 Ion Proton。
【专利摘要】本发明涉及检测染色体异常的方法，具体地讲，本发明涉及胎儿染色体异常例如三体性21 (唐氏综合征)的诊断，其包括在胎儿妊娠期间得自母体血液的血浆样品中的无细胞DNA分子的序列分析。
【IPC分类】C12Q1/68
【公开号】CN104968800
【申请号】CN201380056824
【发明人】C.E.S.罗伯茨, R.奥尔德, F.克雷亚
【申请人】普莱梅沙有限公司
【公开日】2015年10月7日
【申请日】2013年8月29日
【公告号】CA2883464A1, EP2890813A1, US20150267255, WO2014033455A1