使用受体Na/K-ATPase/Src复合物进行的测定法和基于细胞的测试及其用图
【专利说明】使用受体Na/K-ATPase/Src复合物进行的测定法和基于细 胞的测试及其用途
[0001] 发明人：谢子建，Joseph I. Shapiro,赖芳芳
[0002] 相关申请的交叉引用
[0003] 本申请要求美国临时申请序列号61/664, 232 (提交于2012年5月8日）的权益， 其全部公开明确地通过引用并入本文。
[0004] 关于联邦资助研宄的声明
[0005] 本发明在美国政府支持下进行，基金编号为HL-109015,由美国国立卫生研宄院基 金编号颁布。美国政府拥有本发明的特定权利。
[0006] 本发明技术领域及工业应用
[0007] 本发明涉及操作方法，其筛选受体Na/K-ATPase/Src的激动剂和拮抗剂，并涉及 鉴定不饱和脂肪酸、二硫化谷胱甘肽（GSSG)和有机硫化合物衍生物鉴定为部分激动剂，鉴 定MB-5、姜黄素、姜黄素衍生物、丹参素、丹参酮、丹参酮衍生物、黄芪甲苷IV和阿魏酸为受 体拮抗剂。
[0008] 发明背景
[0009] 癌症是全球死亡发生的主要致因。根据世界卫生组织（WHO)统计，2008年癌症在 世界范围引起的死亡为760万例，占总死亡的约13%，预期这一数字到2030年为止会增加 到1200万例。充血性心脏衰竭（Congestive Heart Failure，CHF)的发生率也呈上升趋 势，在美国有500万人受其影响。1000名70岁以上人群中有大约8人被诊断为患有CHF。
[0010] 因为受体Na/K-ATPase/Src复合物的激动剂造成的生理刺激对正常的肾、心和肺 功能的维持十分重要，且其能保护器官，所以对受体Na/K-ATPase/Src复合物的激动剂的 开发是有益的。因为持续的刺激会导致异常生长（肿瘤）和器官纤维化，所以拮抗剂的开 发可用于癌症和慢性器官退行疾病的治疗剂。
[0011] Na/K-ATPase在维持细胞、器官和整个身体中电解质和液体平衡中起作用。哺乳动 物细胞的Na/K-ATPase与多种膜及细胞溶胶蛋白质相互作用，由此起到信号传导受体的作 用。Src是一种非受体酪氨酸激酶，能与Na/K-ATPase形成受体复合物并调节细胞生长、分 化、凋亡和纤维化，见图1的示意图。
[0012] 生理浓度的强心类固醇对Src受体复合物的激活在肾脏、心血管功能调节上有重 要作用。此外，Src受体复合物的持续激活导致ROS应激反应，其促进多种疾病的发生，包 括癌症、高血压、先兆子痫，终末期肾病，充血性心脏衰竭和糖尿病。
[0013] Na/K-ATPase酶广泛表达于大多数真核细胞中并对维持跨膜离子梯度至关重要， 其通过将Na +泵出细胞并将K+泵入细胞。在结构上，该酶由两个非共价连接的a和0亚 基构成。Na/K-ATPase的a亚基具有10个跨膜结构域，其N-和C-末端都位于细胞质中。 a亚基由数个得到良好表征的结构域构成：执行子（A)结构域由N-末端和第二个连接于 跨膜螺旋M2和M3的细胞溶胶结构域（CD2)构成；高度保守的不连续磷酸化（P)结构域靠 近质膜；以及一个相对分离的核苷酸结合（N)结构域。在离子泵循环中，这些结构还显示有 A和N结构域的显著运动。在传输循环中，A结构域旋转，而N结构域闭合，这开启了（El) 并关闭了（E2)A、N和P结构域。
[0014] 先前，本发明人和其他人员已经证明强心类固醇（Cardiotonic Steroid，CTS)如 乌本苷与Na/K-ATPase的结合刺激多个蛋白质激酶的级联效应。此外，Src的敲除消除了 这些激活效应中的大部分。Src作为Src家族非受体激酶家族的成员之一，在很多细胞外刺 激即细胞因子、生长因子和应激反应的信号转导通路中起重要作用，而且是特定癌症和骨 病中进行治疗干预的良好革巴标。
[0015] Na/K-ATPase与Src通过至少两个结合基序直接相互作用：一个基序在a 1亚基 的⑶2和Src SH2之间；另一个涉及到第三细胞溶胶结构域（⑶3)和Src激酶结构域。所 形成的该Na/K-ATPase和Src的复合物起受体作用，由此引发蛋白质激酶的级联效应。
[0016] 例如，乌本苷与Na/K-ATPase的结合会破坏后者的相互作用然后导致不同通路的 组装和激活，包括ERK级联反应、PLC/PKC通路及线粒体中ROS产生。此外，这种相互作用使 Src保持失活状态。因此，Na/K-ATPase起到内源Src负调节子的作用。见例如共同发明人 的待审申请：美国出版号2011/0245167(出版于2011年10月6日）、PCT/US07/023,011(提 交于2007年10月17日（出版号为W02808/054792, 2008年5月8日），其要求美国序列号 60/855,482(提交于2006年10月16日）的优先权，这些申请明确地通过引用并入本文。
[0017] 有对革巴向新发现的Na/K-ATPase/Src受体复合物，以开发新型受体激动剂或诘抗 剂的需要，使Na/K-ATPase/Src复合物的受体功能可以得到刺激（用于处理如心肌缺血/ 再灌注损伤等疾病）或得到抑制（用于处理组织纤维化、充血性心脏衰竭和癌症等疾病）。 [0018]因为有着各自自身目的功能结构域形式的相关蛋白质的整个家族都能得到鉴别， 所以这种通用方法将具有极大的适用性。对这些相关蛋白质的了解将极大地帮助我们理解 多种生理学过程，包括细胞生长或死亡、恶变、肾脏/心血管功能及免疫反应。
[0019] 这种方法还有助于不断发展更加有效的治疗性、诊断性或预防性试剂，其具有 更少的副作用。这一点的重要性不断增加，因为目前人们相信传统中医（TCM)用于处理 患者的用途是温和疗法，同时也具有高度的商业性。植物及其提取物一度是治疗者用于 处理患者的最重要的物群。世界范围的人群中有很多仍然严重依赖于草药药物（herbal medicine)作为其主要的治疗来源。而且，目前处方药物中很多活性组分都是首次在植物中 鉴定出的，而且现今最受欢迎的药物中有很多来源于植物材料。
[0020] 另外，这种备选的医疗手段得到越来越广泛的接受，在美国也得到使用，用于处理 广泛的病况及健康的维持。据估计，两个美国人中就有一个正不时使用替代疗法。具体而 言，患者处理其癌症的最受欢迎的补充手段或完全的替代手段是使用植物性试剂/草药。
[0021] 尽管对人类患者施用植物或其提取物的这种方法已经进行了数个世纪，但仍不能 够确定何种精确的量能提供有效性。即，由于植物的本质是活体形式，所以由于其中有效成 分的量可能不同，使得每个植物都是独特的。另外，不同的变化情况会导致含有不同量的有 效成分；例如，有人已经注意到如果植物来源于气候更热带的地区，则果实会更辛辣。
[0022] 具体而言，传统中医（TCM)经常是患者选择其他和/或替代手段处理其障碍时的 一种处理模式选项。例如，患者既使用TCM作为抗癌试剂，也用其减轻标准化疗的副作用。 然而，TCM缺少西医所要求的科学健全的方法论，且使用TCM经常有效或无效。
[0023] 仍然有发现特异性草药提取物（herbal extracts)及其组合的需要，其具有特异 的实用性并且有科学证据证明其能在所述用途中起作用的机制。
[0024] 本发明提供的正是这样的新型组合物和方法。
[0025] 发明概述
[0026] Na/K-ATPase a 1亚基和Src能形成受体复合物。如图1中所示，内源的强心类固 醇（CTS)和洋地黄类药物如乌本苷起激动剂的作用并调动所述受体复合物。随后，引起下 游蛋白质激酶的级联效应。通过这些受体Na/K-ATPase/Src复合物激活的这些通路在调控 细胞生长、肾盐处理和器官重塑方面起重要作用。
[0027] 本文描述的是一种鉴定改变Src活性的化合物的方法，其中所述方法包含：
[0028] i)纯化a I Na/K-ATPase 以获得 Na/K-ATPase，其显示了高于 800 y mol Pi/mg蛋 白质A的特异活性；
[0029] ii)将步骤（i)中纯化的Na/K-ATPase与Src混合，以形成Src活性受抑制的受体 Na/K-ATPase/Src复合物；
[0030] iii)将步骤（ii)中的受体Na/K-ATPase/Src复合物暴露于化合物，其中该化合物 的结合将受抑制的Src从受体Na/K-ATPase/Src复合物中释放，导致Src活性的增加；以及
[0031] iv)测量Src活性的增加，其中增加的Src活性指示该化合物改变了 Src的活性。
[0032] 在特定实施方式中，所述方法包括确定相比于Src活性的对照水平，是否有Src活 性的增强水平，其中Src活性水平的增强指示该化合物为激动剂，而其中相对于对照水平， Src活性水平的降低指示该化合物为拮抗剂。
[0033] 在特定实施方式中，受体Na/K-ATPase/Src复合物的激动剂包含强心类固醇。
[0034] 在特定实施方式中，受体Na/K-ATPase/Src复合物的激动剂包含乌本苷、地高辛、 海蟾蜍毒素（MBG)、油酸、二十二碳六烯酸（DHA)、谷胱甘肽二硫化物（GSSG)和异硫氰酸烯 丙酯中的至少一种或多种。
[0035] 在特定实施方式中，受体Na/K-ATPase/Src复合物的拮抗剂包含3, 4, 5-三羟基咕 吨酮（MB5)、3,4,5,6-四羟基咕吨酮（MB7)、姜黄素、双脱甲氧基姜黄素、丹参酮I、丹参素 钠、黄芪甲苷IV、阿魏酸和丹参酮IIA中的两种或多种。
[0036]在特定实施方式中，受体Na/K-ATPase/Src复合物的拮抗剂包括丹参酮I、丹参素 钠、黄芪甲苷IV和阿魏酸的组合。
[0037] 在特定实施方式中，受体Na/K-ATPase/Src复合物的激动剂可见于党参、血参根、 丹参（radixsalviamiltiorrhizae)、当归、西当归(angelicasinensis)、黄苗和黄耆 (astragalus)中的一种或多种。
[0038] 在特定实施方式中，所述化合物用于处理与心脏肥大、组织纤维化、充血性心脏衰 竭、癌症、伤口或皮肤损伤中一种或多种相关的障碍。
[0039] 在特定实施方式中，所述化合物被鉴定用于处理某种障碍，所述方法进一步包括： 用该化合物进行测定法，以：i)如果化合物为激动剂，使Src从受体Na/K-ATPase复合物中 释放；或ii)如果化合物为诘抗剂，阻止Src从受体Na/K-ATPase复合物中释放；并确定化 合物是否为Src激活剂或非ATP-竞争性的Src抑制剂，其中显著抑制所述障碍的化合物为 适于处理所述障碍的化合物。
[0040] 在特定实施方式中，所述方法包括诊断受试者是否患有某种障碍，通过：提供来 自受试者的样品；将样品与受体Na/K-ATPase复合物相接触；确定样品中Src活性的水平 并与参照物相比较，其中与参照物比较Src活性的水平有差异则指示该受试者患有此种障 碍。
[0041] 在特定实施方式中，所述方法评估用于障碍的处理，通过：提供来自受试者的样 品；将样品与受体NaA-ATPase复合物相接触；施用一种或多种剂量的处理；确定样品中 Src活性的水平，与参照物相比较，其中与参照物比较Src活性的水平有差异则指示所述处 理有效。
[0042] 在特定实施方式中，所述方法包括确定受试者患上某种障碍的并发症的风险，通 过：提供来自受试者的样品；将样品与受体Na/K-ATPase复合物相接触；确定样品中Src活 性的水平，与参照物相比较，其中与参照物比较Src活性的水平有差异则指示受试者有患 上该并发症的风险。
[0043] 在特定实施方式中，所述方法包括确定何时可以终止施用于受试者以处理某种障 碍的处理模式，通过：提供来自受试者的样品；将样品与受体Na/K-ATPase复合物相接触； 确定样品中Src活性的水平，与参照物相比较，其中Src活性的接近参照物中Src的水平则 指示所述处理可被终止。
[0044] 在特定实施方式中，所述方法包括确定何时可以在受试者中