活、无病存活、慢性疾病、转移恶化、晚期或严重疾病、疾病复发、死亡以及对 疗法产生良好或较差的应答。
[0110] 术语"存活的降低"通常指受试者死亡前的时间长度的降低，或受试者死亡风险的 增加。
[0111] 术语"对照"通常指用于与实验样品（如获自受试者的样品）进行比较的样品或 标准品。在一些实施方式中，对照是获自健康受试者的样品。在一些实施方式中，对照是获 自相同受试者的细胞/组织样品。在一些实施方式中，对照是历史对照或标准值（即，先前 经测试的对照样品或一组样品，其代表基线或正常值，如对照样品中的水平）。在其他实施 方式中，对照是获自健康受试者如供体的样品。测试样品和对照样品可根据本领域任何已 知方法获得。
[0112] 术语"防止"、"阻止"和"预防"通常指代受试者中疾病或障碍的发生率降低。预 防可以是彻底的，即受试者完全不会发生所述疾病或障碍。预防也可以是部分的，即受试者 中所述疾病或障碍的发生率低于如果未经本发明实施方式处理时的发生率。"阻止"疾病通 常指抑制疾病的完全发展。
[0113] 术语"处理"和/或"改善疾病"通常指代在疾病已经开始发展后改善疾病或障碍 的症状的治疗干预。"改善"通常指疾病或障碍的表征或症状的数量或严重性的减少。
[0114] 术语"受试者"包括人和非人动物。用于进行处理的优选受试者为人。"受试者" 和"受试体"在本文交换使用。
[0115] 术语"治疗性"通常是一个通用术语，包括诊断和处理两方面。
[0116] 术语"治疗剂"通常指代化学化合物、小分子或其他组合物，当以适当方式施用于 受试者时，其能够诱导产生所期望的治疗性或预防性效应。多种治疗剂可同时或顺序地使 用。
[0117] 如本文所使用的，"候选试剂"是被选择进行筛选以确定其是否能起治疗剂功能的 化合物。"孵育"包括使试剂与细胞或组织相互作用一段足够的时间。"接触"包括将固体 或液体形式的试剂与细胞或组织进行孵育。用试剂"处理"细胞或组织包括将试剂与细胞 或组织进行接触或孵育。
[0118] 术语"治疗有效量"通常指足以使得障碍的一种或多种症状得到改善或阻止障碍 的进展，或者引起疾病或障碍的消退的治疗剂的量。"治疗有效量"可以是足以在以所述 试剂处理的受试者或细胞中达到期望的效应指定的药品或治疗剂的量。例如，可以是改变 miR/s表达并由此阻止、处理或改善受试者的疾病或障碍的治疗剂的量。试剂的有效量会依 赖于数种因素，包括但不限于受到处理的受试者或细胞以及所述治疗组合物的施用方式。
[0119] 如本文所使用的，"药物组合物"包括用于人和兽医用途的制剂。用于制备本发 明药物组合物的方法在本领域技术人员能力范围内，例如在Remington's Pharmaceutical Science, 17th ed.，Mack Publishing Company, Easton, Pa. (1985)中描述的，其全部公开 通过引用并入本文。
[0120] 术语"药物可接受媒介物"通常指代通常会使用的那些药物可接受载体（媒 介物）° Remington's Pharmaceutical Sciences, by E.W.Martin, Mack Publishing Co.，Easton, PA, 20 Edition,描述了适合用于递送一种或多种治疗性化合物、分子或试剂 的组合物和配方。通常，载体的性质会取决于采用的具体施用模式。例如，肠道外制剂常常 包含可注射液体，其包括药物和生理学可接受液体如水、生理盐水、平衡的盐溶液、葡萄糖 水溶液、甘油等等，作为媒介物。对于固体组合物（例如粉剂、丸剂、片剂或胶囊形式），常规 非毒性固体载体可包括例如药物级的甘露糖、乳糖、淀粉或硬脂酸镁。除了生物学中性的载 体外，要施用的药物组合物可含有少量的非毒性辅助物质，如增湿或乳化试剂、防腐剂和PH 缓冲试剂等等，例如醋酸钠或单月桂酸酯山梨糖醇。
[0121] 术语"药物可接受盐"通常指代任何本发明实施方式的化合物的盐（例如由用酸 或碱反应获得的），其在靶标动物（例如哺乳动物）中是生理学上耐受的。本发明实施方 式的化合物盐可来源于无机或有机的酸和碱。酸的实例包括但不限于，盐酸、氢溴酸、硫酸、 硝酸、高氯酸、富马酸、马来酸、磷酸、乙醇酸、乳酸、水杨酸、琥珀酸、甲苯对磺酸、酒石酸、醋 酸、柠檬酸、甲磺酸、乙磺酸、甲酸、苯甲酸、丙二酸、磺酸、2-萘磺酸、苯磺酸等。其他酸如草 酸虽然自身不是药物可接受的，但可以用于制备作为获得本发明实施方式的化合物所需中 间物的盐以及所述化合物的药物可接受的酸加成盐。碱的实例包括但不限于碱金属（例 如钠）氢氧化物、碱土金属（例如镁）氢氧化物、铵，等等。盐的实例包括但不限于：醋酸 盐、己二酸盐、藻酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟 脑酸盐（camphorate)、樟脑磺酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸 盐、富马酸盐、氟庚酸盐（flucoh印tanoate)、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氯化 物、溴化物、碘化物、2-羟基乙磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐（mesylate)、甲磺酸盐 (methanesulfonate)、2_萘磺酸盐、烟酸盐、草酸盐、双轻萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、苯基 丙酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐（Pivalate)、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸 盐、十一烷酸盐，等等。盐的其他实例包括本发明实施方式的化合物的阴离子与合适的阳离 子如Na+、NH4+和NW4+(其中W是C1-4烷基基团）等形成的化合物。为用于治疗用途，设 想本发明实施方式的化合物的盐应是药物可接受的。然而，非药物可接受的酸和碱的盐也 可用于例如药物可接受化合物的制备或纯化过程中。
[0122] 如本文所使用的，术语"化合物"和"试剂"通常被视为是同义词，因此可交换使用， 除非上下文另有说明。
[0123] 如本文所使用的，术语"基本上纯"指的是材料基本上不含与其天然状态相结合的 序列和/或分子以及分离步骤中使用的那些分子。术语"基本上纯"还包括将多核苷酸或 多肽纯化至接近均一的状态。术语"基本上不含"指的是样品不含与其天然结合的材料和 化合物的程度达到至少50 %、优选地至少70 %、更优选地为80 %、更优选地为90 %，最优选 地为99%。
[0124] 概述
[0125]本发明至少部分基于发明者的这一发现，即Na/K-ATPase结合并抑制Src。如本文 所使用的，"Src"指的是非受体酪氨酸激酶。
[0126] 首先，参照图1，其为Na/K-ATPase/Src受体复合物的示例说明。图1中的图例包 括：EGFR，表皮生长因子受体；IP3R，IP3受体；PI3K，磷脂酰肌醇3-激酶；PKC蛋白质激酶C ; PLC磷酸醋酶C;Grb2,生长因子受体结合蛋白质2 ;S0S，无七的儿子（son of sevenless); She，Src同源胶原蛋白样蛋白；MAPK，丝裂原活化蛋白激酶；MEK，MAPK-ERK活化激酶；R0S， 活性氧。
[0127] 如图1中所显示的，受体复合物存在于胞膜窖（caveolae)中。乌本苷结合至受体 复合物导致Src的激活，然后转激活EGFR，随后刺激数个蛋白质和脂质级联效应。在非限制 性实例中，受体拮抗剂用于伤口愈合和抗皱的用途。在非限制性实例中，受体拮抗剂用于癌 症、纤维化CHF和CRF。
[0128] 参照图2A和2B，其显示了激动剂和诘抗剂的基于FRET的高通量测定法的示意图。 图2A显示了 Na/K-ATPase/Src受体的激动剂筛选的示意图。使用了基于通路的手段筛选 Na/K-ATPase/Src受体祀标物的激动剂。激动剂可与Na/K-ATPase相互作用，导致Src磷酸 化。活性Src将ATP的Y-磷酸转移到合成肽底物的单个酪氨酸残基上。然后，位点特异 性蛋白酶识别并裂解非磷酸化的肽。通过显色反应剂显示磷酸化肽的裂解程度受到抑制。 裂解破坏了肽上的FRET，而未裂解的磷酸化的肽保持FRET现象。
[0129] 图2B显示了Na/K-ATPase/Src受体复合物的诘抗剂筛选示意图。该测定法与激 动剂筛选类似。例如，在乌本苷存在下，拮抗剂可减少乌本苷诱导的肽底物磷酸化。
[0130] 在一个实施例中，基于FRET的体外高通量测定法利用受体Na/K-ATPase和Src 的体外重构，以及基于Src肽底物的FRET测定法。从猪肾中纯化出al Na/K-ATPase，在 测定法中使用了特异活性高于800 ymol Pi/mg蛋白质/h的制备物。为重构受体al Na/ K-ATPase亚基/Src复合物，将纯化的猪肾Na/K-ATPase与纯化的重组Src混合。该受体复 合物具有抑制的Src活性。激动剂与受体结合将释放受抑制的Src并致使Src活性增加， 这一点通过基于肽的FRET分析得到测量（图2A，图2B)。为筛选受体Na/K-ATPase/Src复 合物的激动剂，将重构的受体暴露于化合物，然后使用基于肽的FRET测定法测量Src激活。
[0131] 例如，图2C显示了在用于筛选受体激动剂或拮抗剂的重构的Na/K-ATPase/Src复 合物系统中MB5对乌本苷诱导的Src激活的拮抗效应。SrcpY 418的磷酸化是Src激活 的指示物，通过Western印迹测量。使用I y M的乌本苷，并且在100 yMvanade的存在下 灭活ATPase活性，完成该测定。数值为至少三次独立实验的平均值土S.E.。*与对照比较 p〈0.05。#与对照比较p〈0.01。
[0132] 图2D显示了丹参酮I和丹参酮IIA对乌本苷诱导的Src激活的拮抗效应。所述 测定使用与图2C中相同的方法完成。
[0133] 油酸（OA)对Na/K-ATPase/Src复合物的效应显示于图2D和图2E。将不同浓度的 OA与Na/K-ATPase/Src受体共同孵育15min，随后加入ATP并测定pY418磷酸化情况。数 值为至少三次独立实验的平均值土S.E.。林与乌本苷组比较p〈0. 01。##与未处理组比较 p<0. 01〇
[0134] 为确认这些激动剂通过Na/K-ATPase激活Src，建立三项基于互补细胞的测定法。 其中一项测定法使用来自LLC-PKl的a 1敲减的PY-17细胞、对照细胞Pll (用空载体转染 的LLC-PK1)，及另一种对照细胞AAC-19 (大鼠的a 1-挽救PY-17细胞）。当这些化合物在 Pll和AAC-19细胞中激活Src时，Na/K-ATPase的敲减消除了其在PY-17细胞中的效应，这 一点确认Na/K-ATPase确实是受体，这一点在乌本苷暴露实验中也得到证明（图3A)。
[0135] 类似地，油酸在LLC-PKl细胞而不是在PY-17细胞中激活Src (图3B)。第二项测定 法使用另一对细胞系，LL-A416P-4和LL-A420P-20。这些细胞是大鼠a 1的A416P及A420P 突变体挽救的PY-17细胞。
[0136] 如图4A-4B中所示，A420突变为P致使所表达的Na/K-ATPase不能结合并形成功 能性的受体复合物在A416P-挽救的细胞中作为乌本苷激活的Src，而在A420P突变体-挽 救的细胞中则并非如此。用于激动剂（乌本苷）的基于细胞（LL-A416P-4和LL-A420P-20) 的测定法：用所示浓度的乌本苷对细胞处理lOmin，就pY418和总Src分析全细胞裂解液。 图4A显示Western印迹结果。图4B显示组合的定量数据。数值为至少三次独立实验的平 均值土 S. E.。*与每种对照相比p〈0. 05。
[0137] 第三项测定法使用其他两种细胞系（LY-I279A-3、LY-F286A-19)，其中所表达的 I279A或F286A突变体Na/K-ATPase不能进行构象转变（I279A和F286A突变体分别不能 进行El向E2和E2向El的构象转变）。如图5中所示，一旦构象转变受到抑制，则乌本苷 不再能在这些突变体细胞中激活Src。用于激动剂（乌本苷）的基于细胞（LY-I279A-3和 LY-F286A-19)的测定法：用所示浓度的乌本苷对细胞处理lOmin，就pY418和总Src分析全 细胞裂解液。图5A显示Western印迹结果，图5B显示