在自发髓鞘再生期间，过氧化物酶体增生物活化受体δ (PPARS)激动 剂工具化合物（以下称为'517)在171系杂合小鼠中提高荧光素酶的成像信号。将8周龄 的髓鞘碱性蛋白荧光素酶小鼠（171杂合的，B6C3H品系）用含有0.2%铜宗的饮食处理4 周，然后用正常饮食（normal chow diet)处理，使髓鞘再生。然后将小鼠每日二次口服媒 介物（0.6%羧甲基纤维素钠盐与0.5%聚山梨醇酯80)或30毫克/公斤的过氧化物酶体 增生物活化受体S激动剂工具化合物'517达8日，并在指定时间点图像化。将数据标准 化至零周的基线信号。与媒介物组（η = 12)相比，工具化合物'517(n= 12)导致荧光素 酶信号相对增加30-100%，其已被归因于所述化合物刺激少突胶质细胞的祖细胞分化作用 的影响（例如，与体外研宄结果一致）。
[0105] 图16 :过氧化物酶体增生物活化受体δ激动剂工具化合物' 517改善在髓鞘再生 期间勒克司坚牢蓝（LFB)髓鞘染色（171系杂合的，B6C3H品系）。将来自福尔马林固定石 蜡包埋的脑部的矢状窦旁组织切片以勒克司坚牢蓝染色，用于定性评价胼胝体中的髓鞘。 对每一时间点的染色切片进行评分及分级，等级由〇 (完全髓鞘形成）至5 (完全脱髓鞘）。 评分系统如下：〇=正常髓鞘，无脱髓鞘作用；1 =最小局部脱髓鞘；2 =轻至中度局部脱髓 鞘；3 =中度局部广泛性脱髓鞘；4 =严重局部广泛性脱髓鞘；5 =严重扩散性脱髓鞘。在4 周铜宗处理后，来自小鼠的勒克司坚牢蓝染色脑切片的组织学评价证实在171系杂合小鼠 (η = 5)中的胼胝体的中度至严重脱髓鞘作用。工具化合物' 517组（η = 5)与媒介物对照 组（η = 3)相比，在髓鞘再生期间从第4周至第5周的' 517处理导致通过勒克司坚牢蓝在 第7周时间点所测的可测量的髓鞘增加。尽管实验个体数量少，但是组织学数据支持体内 荧光素酶生物成像数据，显示当与媒介物对照相比时，用' 517化合物处理的小鼠的髓鞘再 生增加。
[0106] 图17 :在铜宗模型中，在脱髓鞘作用期间的30毫克/公斤的雌激素受体β (ERf3) 激动剂（以下称为'5a)及10毫克/公斤的正对照喹硫平（Quetiapine)为保护性的。将髓 鞘碱性蛋白荧光素酶171系杂合B6C3H小鼠喂食铜宗饮食4周，并口服' 5a (10毫克/公斤 或30毫克/公斤）或正对照喹硫平（QTP)。将小鼠在第0周（基线）、第3周及第4周图 像化，并将数据标准化至第0周的基线。对于第3周及第4周的时间点，在10毫克/公斤， 喹硫平组与媒介物对照相比呈现显著成像信号增加。喹硫平处理组的结果与Yanbo Zhang 等人发表的数据一致，其标题为"喹硫平缓解C57BL/6小鼠脑中由铜宗引起的脑白质病变 (Quetiapine alleviates the cuprizone-induced white matter pathology in brain of C57BL/6 mouse)"（Schizophrenia Research, 2008, Dec 106,182-91)。与媒介物相比， 30毫克/公斤的化合物' 5a在铜宗饮食第3周（趋势）及第4周（明显）显示信号增强。 10毫克/公斤的' 5a在第3及第4周无显著效果。结果表明，该髓鞘碱性蛋白荧光素酶成 像模型足以灵敏至检测铜宗模型中的剂量依赖性变化。
[0107] 图18 :与第3及第4周的媒介物对照组相比，' 5a(30毫克/公斤）与喹硫平（10 毫克/公斤）组具有显著较强的转基因活性。成像模型数据支持喹硫平及'5a二者减弱铜 宗引起的脑脱髓鞘作用及髓鞘破坏。
[0108] 图19显示在纯合与杂合小鼠（B6C3H，171系）之间的铜宗模型成像信号比较。将 N3代的杂合小鼠品种间互交以产生髓鞘碱性蛋白荧光素酶等位基因的纯合小鼠。在铜宗处 理期间，纯合小鼠较杂合小鼠表达超过2倍的生物成像信号窗。纯合子中的两份报道基因 拷贝在脱髓鞘期间（例如，铜宗饮食4周后）呈现超过2倍的信号降低，且在髓鞘再生期间 (例如，移除铜宗饮食并回复正常饮食1周后）呈现2倍信号增加。
[0109] 虽然数据已证明171杂合系（B6C3H品系）在铜宗模型中起作用，并可检测化合物 功效，但是该模型可通过育种进一步改良为纯合性，以增加生物成像信号强度。由于可将小 鼠群落维持为纯合子，这也简化模型生产，并降低基因分型成本。总的来说，更大成像窗可 在药理化合物分析研宄中扩大化合物功效的检测。
[0110] 图20 :以勒克司坚牢蓝染色的来自福尔马林固定石蜡包埋的小鼠脑的矢状窦旁 组织切片中的胼胝体（括号201中的暗纵向结构）的显微照片表示评价髓鞘状态的白质区 域。此区域用于胼胝体的勒克司坚牢蓝（LFB)染色的定量数字成像分析。
[0111] 图21 :三种不同髓鞘碱性蛋白荧光素酶系（171系B6C3H杂合品系、121系C57BL/6 杂合品系及171系B6C3H纯合品系）的成像窗及组织学窗的比较。将小鼠用含有0.2%铜 宗的饮食处理4周或5周。将成像数据标准化至第0周的基线测量值。在每一研宄结束时 收取小鼠脑，并以勒克司坚牢蓝（LFB)针对髓鞘染色连续石蜡切片。平均定性勒克司坚牢 蓝评分（0至5)显示在表中。171系B6C3H纯合小鼠呈现最大成像信号降低，也证实如定性 组织学所评价的最严重脱髓鞘作用。171系B6C3H杂合小鼠呈现最小成像窗，也在第4周呈 现最少组织学脱髓鞘作用。
[0112] 图22通过对喹硫平（QTP)治疗应答的示范，进一步证实铜宗模型中171系纯合小 鼠的用途。将小鼠喂食铜宗饮食5周，并同时每日口服喹硫平（10毫克/公斤）。将小鼠在 第0周（基线）、第3周及第5周成像。将数据标准化至第0周基线测量值。与媒介物对照 相比，喹硫平（10毫克/公斤）在第3周及第4周的时间点都导致显著成像信号增加。结 果与171系杂合小鼠获得的结果（图17及18) -致。数据表示，171系纯合小鼠可用于评 价在铜宗模型中化合物维持髓鞘表达及完整性的功效。
[0113] 图23 :来自121系小鼠的体外脊髓成像。发光的覆盖说明，将转基因表达定位于 脑与脊髓的白质区。这进一步支持由全动物生物成像实验所得的结论。
[0114] 图24 :在C57B1/6小鼠、野生型、171系杂合及171系纯合小鼠中的胼胝体的勒克 司坚牢蓝（LFB)染色的定量数字图像分析。在染色载玻片的扫描数字图像上的胼胝体人工 略画区域上，使用Aperio8色彩反卷积运算法计算胼胝体中阳性勒克司坚牢蓝染色百分面 积的量。对于每只动物，评价一片切片。每组的动物数量在9至10只之间变动。对于每只 动物及各组，计算阳性勒克司坚牢蓝染色百分面积。通过配对t检定评价各组之间的统计 显著性。在4周铜宗喂食后，171纯合小鼠及野生C57BL/6小鼠都呈现严重脱髓鞘作用（阳 性染色百分面积介于40%至60%)。相对地，171系杂合小鼠仅呈现轻微脱髓鞘作用（阳 性染色百分面积介于65%至80% )。因此，171系纯合小鼠被认定为在铜宗引发的脱髓鞘 作用模型中使用的优选系。
【具体实施方式】
[0115] 以下五个标准已成功连续应用于对生物成像模型的优化选择：
[0116] 依据以下方法，可由5千碱基对或10千碱基对载体转基因操作的小鼠系产生具体 实施方案。下述结果来自用35个转基因系开始的一个这种筛选方法。图5图示总结此方 法。
[0117] 由制备的转基因系中，选择这样的系：在出生后髓鞘形成高峰时（例如，3-5周第 一代小鼠）的体内全动物（例如，小鼠）成像显示中枢神经系统特异性成像。所选35个系 中的6个系进行下一选择阶段。
[0118] 接着，选择这样的系：体外成像确认，荧光素酶转基因的表达主要在脑白质区中。 来自步骤1的6个系中的5个进行至下一阶段。
[0119] 然后，选择这样的系：荧光素酶图像强度与在此例中的铜宗脱髓鞘作用模型中引 发的脱髓鞘作用与髓鞘再生的变化高度相关。来自步骤2的5个系中的3个进行至下一阶 段。
[0120] 接着，选择这样的系：在上述铜宗模型中呈现清楚组织学脱髓鞘作用。来自步骤3 的3个系中的2个被选为优选系。
[0121] 作为概念的最后验证，我们选择了 一个系，其中可在该生物成像模型中最理想检 测A003398711(-种过氧化物酶体增生物活化受体δ选择性激动剂）的功效。
[0122] 使用以上五个标准选出示例性的系，名为171系（B6C3品系，杂合），并用作优选模 型。
[0123] 这种方法的更详细的描述在下述实施例中描述。
[0124] 定义
[0125] 除非另有说明，本申请使用的术语意义如广泛使用的科学用语，其可能异于口语 一般用法。
[0126] 基因应作广义解释，以包括转录及非转录区。
[0127] 化合物应作广义解释，以包括化学化合物，例如，有机化学实体，生物化合物，例如 抗体及抗原辨识片段与结构，核酸，例如干扰性核糖核酸等。
[0128] 制备表达萤火虫荧光素酶的转基因小鼠。在这些动物中，使报道基因一荧光素酶 与髓鞘碱性蛋白启动子连接，从而当启动髓鞘碱性蛋白表达时，驱动荧光素酶在白质（有 髓）区如中枢神经系统的细胞中的表达。系统性注射（静脉内、腹膜内、皮下）底物荧光素， 由活体小鼠头部产生可检测且可计量的光信号。通过施用铜宗脱髓鞘作用模型以选择髓鞘 碱性蛋白荧光素酶系，并反复以荧光素注射这些动物，可通过非侵袭性生物发光成像，纵向 (例如，历时2个月）连续监测及量化脱髓鞘作用与髓鞘再生。此模型成功定量监测铜宗引 发的脱髓鞘作用及过氧化物酶体增生物活化受体S化合物引发的髓鞘再生。
[0129] 检测器技术的进步导致灵敏度及成像质量的实质改善。现今由专门电荷耦合组件 (CCD)相机检测光子，当光子撞击娃片时，该相机将光子转化为电子。电荷親合组件相机在 空间上将入射光子强度编码为电荷分布图，其然后经处理而产生图像。噪声通过以下方法 降低：超冷却电荷耦合组件相机及将相机安装在暗箱中。在图像获取及分析期间，这些相机 通常由计算机控制。第二代相机系统小得多，因此可装置在实验室台顶上，使得该技术对于 日常实验可行及实用。Xenogene公司（Xenogene Company)已将生物成像技术商业化。
[0130] 在现有成像样式中，基于生物发光或荧光的光学技术已变得最方便及容易操作。 由于来自组织的本底发光（噪声）极低，生物发光成像（BLI)的特征在于显著的灵敏度。迄 今为止，生物发光成像已成功用于监测生物过程，例如，在各种动物模型中的细胞运动、月中 瘤发展、基因表达及病毒感染。
[0131] 萤火虫荧光素酶需要细胞内辅因子如三磷酸腺苷用于活动。这将其使用限于基因 工程化以表达该酶的细胞。因此，许多有用的成像应用如监测循环因子的分布、检测细胞外 抗原表达以及标记内源性细胞不适用于萤火虫荧光素酶成像。萤火虫荧光素酶的另一缺点 是在固定的细胞与组织样品中缺乏替代的底物来检测它。这使得难以结合体内成像与显微 分析。
[0132] 从内部器官放射的光的检测灵敏度取决于数种因素，包括荧光素酶表达的水平、 标记细胞在体内的深度（光子必须通过组织的距离），以及检测系统的灵敏度。
[0133] 使用非侵袭性全动物成像监测荧光素酶报道基因表达盒的表达已有描 述（Contag，C.，U. S. Pat. N。· 5, 650，135, Jul. 22，1997, herein incorporated by reference ;Contag，P.等，Nature Medicine 4 (2) :245-247, 1998 ;Contag，C.等，OSA TOPS on Biomedical Optical Spectroscopy and Diagnostics 3:220-224,1996； Contag, C. H. , , Photochemistry and Photobiology 66(4):523-531, 1997 ；Contag,C. H. , al, Molecular Microbiology 18 (4) : 593-603, 1995)。这种成像一般使用至少一种光检 测仪器设备，例如电荷耦合组件（CCD)相机。
[0134] 髓鞘碱性蛋白基因的控制元件
[0135] 髓鞘碱性蛋白（MBP)是多肽家族，主要表达在神经系统中，其中它们在髓鞘形成 中扮演重要角色。主要在转录水平调节髓鞘碱性蛋白的表达，例如在分化少突胶质细胞中。 在神经科学期刊（Journal of Neuroscience)中，Farhadi等人描述了新的调节组合元件， 其在时间上控制髓鞘碱性蛋白基因的表达。
[0136] Farhadi等人证实，神经胶质细胞在髓鞘形成开始期间及随后的各个阶段使用不 同的调节序列组合来控制髓鞘碱性蛋白的表达。
[0137] 髓鞘碱性蛋白（MBP)为正常髓鞘致密性所需，并牵涉在实验性及人类脱髓鞘疾病 如多发性硬化（MS)中。
[0138] 为了进一步促进髓鞘生物学的理解并在活体动物中测试髓鞘强化化合物，本发明 使用髓鞘碱性蛋白启动子性质及最灵敏的荧光素酶报道基因技术产生本发明髓鞘碱性蛋 白荧光素酶模型。该模型目前允许在活体动物中灵敏地体内测量髓鞘基因转录应答。
[0139] 髓鞘碱性蛋白荧光素酶报告盒的构建
[0140] 以位于髓鞘碱性蛋白启动子M3区域中的探针筛选129SvEv细菌人工染色体基因 库（Cell&Molecular Technologies)。该探针具有507个喊基对，并由引物对（5' -actcct taccacacttcttgcagg-3' 5' -tctattgggtgatgtgtgccatc-3) (SEQ ID Nos. 1 及 2)产生。通 过Southern分析（Sout