（1)繁殖成纯合体型以增加生物成像信号 强度，并减少模型生产及基因型成本；（2)繁殖成白化品系如C57品系，以用白毛降低成像 信号衰减，和减轻多次除毛后的皮肤反应；(3)将121系繁殖成C57BL/6品系，以匹配内部 研发的中枢神经系统铜宗模型品系。
[0181] 我们目前已经证实，171系纯合系比171系杂合系（每一细胞2个报道基因基因盒 拷贝）呈现超过两倍的生物成像窗。其它实验也证实白化C57应答于铜宗模型。
[0182] 成像系统与数据分析
[0183] 使用IVIS成像系统（Xenogen Corp.，Alameda，CA)非侵袭性测量生物发光。除非 本申请另有说明，在腹膜内注射焚光素（250毫克/公斤-I ;Xenogene Corp.) 10分钟后成 像，60秒采集（60-s acquisition)，面元10(binning 10)。在图像采集期间，通过吸入~ 2%异氟酿（Abbott Laboratories Ltd. ,Kent, United Kingdom)持续镇静小鼠。
[0184] 成像系统描述
[0185] IVIS? 成像系统 100( IVIS? Imaging System IOO(Xenogene))用于收集证实 此发明的数据。Xenogen灵敏IVIS?成像系统100系列（Xenogen' s sensitive IVIS? Imaging System IOOSeries)提供可调式矩形视野，例如，10-25厘米，可成像5只小鼠或 2只大型大鼠，以及一个标准微孔板。该系统特色为25毫米（I. 0英寸）正方形背部薄化 背照式CCD (电荷耦合组件）相机，将其通过闭合循环冷却系统（不具液态氮）低温冷却至 约-90至-120°C，例如-105°C，以最小化电子背景并最大化灵敏度。电荷耦合组件相机设 计用于高效率光子检测，特别是在光谱的红光区中。它可检测极少量的光子，以及如同传统 相机一样操作；在该宽信号范围内显示图像是Xenogen Living Image"软件的功能。具有 六位滤光轮以分隔不同带宽。这种光谱信息可揭示更多来源细胞的深度及分布。冷却电荷 耦合组件相机并优化电子读数，使得搜集的产生实时体内图像的数据具有极低噪声。
[0186] 防光成像室
[0187] 极度防光的低背景成像室允许在标准实验室照明环境中使用IVIS'K)成像系统100 系列。上下移动成像室中的样品搁板以调整视野。研宄者可观看完整动物，或聚焦于一部 分以得到更多细节。加热搁板以增进麻醉动物（例如，小鼠或大鼠）的幸福感。该系统包 括动物操作组件，例如，加热的样品搁板、气体麻醉管线及Xenogen的完全气体麻醉选件一 XGI-8气体麻醉系统（XGI-8 Gas Anesthesia System)(在网页上显示）。较大的成像室可 允许使用较大受试者或较多数量的受试者。
[0188] 用于体内生物发光测定法的荧光素的制备
[0189] 在实施例中使用下列材料：
[0190] 萤火虫 D-荧光素钾盐 1.0 克 / 瓶（例如，Xenogen XR-1001 或 Biosynth L-8220)
[0191] 不含镁离子与钙离子的杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水（DPBS)
[0192] 孔径0. 2微米的瓶口过滤器
[0193] 使用下列步骤成像：
[0194] 制备25毫克/毫升的杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水荧光素原液，并通过0. 2微米过滤 器过滤消毒。分装为5毫升储存在-20°C。注射剂量为10微升/克体重。每一小鼠的目标 是接受250毫克荧光素/公斤体重（例如，对20克的小鼠注射200微升，以递送2. 0毫克 的荧光素）。在成像之前数分钟，皮下注射或腹膜内注射或静脉内注射荧光素。任选对每个 动物模型进行荧光素动力学研宄，以测定高峰信号窗。
[0195] 3. 6髓鞘碱性蛋白荧光素酶成像方法
[0196] 如上所述，小鼠经皮下注射、腹膜内注射或静脉内注射250毫克/公斤的D-荧光 素。在5分钟（静脉内注射）或8分钟（腹膜内注射或皮下注射）之后，将小鼠使用IVIS 100 (Xenogen)图像化16分钟（成像60秒并间隔60秒，共8张图像，面元大小为8)。为了量 化生物发光，定位所研宄的相同圆形区域以包围每一小鼠的头部区域，并使用LIVINGIMAGE 软件（2. 5版，Xenogen)将成像信号量化为平均亮度（光子/秒/平方厘米/球面度）。所 研宄的头部区域在所有实验中保持固定面积及位置。在开始处理每一动物时将数据标准化 为生物发光。
[0197] 3. 7统计分析
[0198] 对于统计分析，使用EverStat V5及Sigma Stat统计软件包。采用组中的平均成 像为平均值，并计算所有组的标准误差（SE)。
[0199] 当比较两组的平均值时，进行成对魏氏检验（paired Wilcoxon test)或非成对魏 氏检验（unpaired Wilcoxon test)。将P〈0. 05的双尾数值视为具统计显著性。
[0200] 实施例
[0201] 转基因小鼠的产生
[0202] "长段"启动子是一段约10千碱基对，含有Ml、M2、M3及M4, "短段"启动子是约5 千碱基对，含有M1、M2及M3。这些启动子以高保真聚合酶链反应方法克隆自含有髓鞘碱性 蛋白基因的小鼠的细菌人工染色体（Bacterial Artificial Chromosome, BAC)。然后将每 一启动子片段克隆至载体中，例如克隆至pGL3-hygr〇载体的多联结位置（图1及图2)。
[0203] 将质粒用Not I及BamHl限制酶切，以释放髓鞘碱性蛋白荧光素酶转基因表达盒 (图3)，其被用于以标准原核显微注射技术产生FVB/Tac及B6C3/Tac品系转基因小鼠。
[0204] 产生转基因（Tg)动物的一般策略为本领域所熟知，例如，如以下文献所述： Pinkert, C. A. (ed. ) 1994. Transgenic animal technology:A laboratory handbook. Academic Press, Inc. , San Diego, Calif. ；Monastersky G. M. and Robl, J. M. (ed. ) (1995) Strategies in transgenic animal science. ASM Press. Washington D. C. 〇
[0205] 与脱髓鞘作用/髓鞘再生活动相关的髓鞘碱性蛋白荧光素酶转基因信号
[0206] 在铜宗模型中使用被发现具有白质区荧光素酶表达的MBP IOK-Iuci 121转基因 系（FVB品系）确证实验。如图11中所示进行第一项铜宗研宄，在第1、2及4周（0. 2%铜 宗饮食）反复进行荧光素酶成像，然后恢复至不含铜宗的正常饮食，并在第5、6及7周反复 进行荧光素酶成像（重复第1至3周）。如图中所示，121系的荧光素酶表达明显与铜宗引 发的脱髓鞘作用和髓鞘再生时间过程相关。这与已发表的内源性髓鞘碱性蛋白信使核糖核 酸研宄一致（Jurevics et al.，Journal of Neurochemistry, 2002, 82, 126-136)。FVB 品 系小鼠只有一种品系，已知对铜宗敏感（通过体重减轻看出）。通常，需要每周补充2至3 次正常食物/转胶，以避免此品系中的严重体重减轻及毒性。
[0207] 铜宗模型确证
[0208] 一种熟知且广泛使用的脱髓鞘作用/髓鞘再生模型是小鼠铜宗模型。此 模型涉及饮食性消耗铜宗，一种铜螯合剂（一般约0.2 % w/w，双环己酮草酰二腙 (CAS#370-81-0, Sigma C9012))，在粉末状啮齿动物实验室食物（powdered rodent Iab chow)中给药一段时间，例如连续4至6周（参见例如，Matsushima and Morell, 2001)。已 显示铜宗对成熟少突胶质细胞具选择性毒性。随后转换铜宗食物为正常食物，制造有利于 复原的环境，使得在停止铜宗喂食4至6周后，小鼠将在胼胝体中呈现广泛髓鞘再生。因此， 铜宗模型提供完全体内范例，以在其中研宄脱髓鞘作用与髓鞘再生的情况（图11及12)。
[0209] 作为进一步证明，测试MBP 5k-luci 171系（B6C3品系）。这种品系也呈现对铜 宗引发的脱髓鞘作用与髓鞘再生活动的相关成像应答，如图13中所示。7只转基因阳性小 鼠以0.2%铜宗处理6周，3只转基因阳性小鼠以正常食物处理6周。所有7只小鼠可耐受 0.2%铜宗饮食，且平均体重减轻为15至25%。以铜宗处理（脱髓鞘作用）会有明显成像 信号降低。例如，从第〇周至第4周降低43 %的信号，而从第0周至第6周降低74 %的信 号。
[0210] 髓鞘碱性蛋白荧光素酶小鼠铜宗模型的组织学确证
[0211] 对于组织学确证，目的是在生物成像模型中证实，报道基因在铜宗处理期间的应 答与铜宗处理的小鼠胼胝体中的结构上可检测的脱髓鞘作用相关。通过勒克司坚牢蓝 (LFB)染色显现这些病理现象（参看图20及24)。
[0212] 具体地，在最初试验中，以0. 2%铜宗喂食的MBP IOk-Iuci 121系（FVB品系）通 过勒克司坚牢蓝染色仅测得少量脱髓鞘作用。为了使这些FVB品系小鼠产生明显的组织学 脱髓鞘作用，随后使用多种喂食铜宗的制度，以试图避免严重体重减轻。〇.2%、0. 175%及 0. 15%铜宗剂量组（6周的研宄）每周需要补充3-4次正常食物/转胶，以避免严重体重减 轻及毒性。此外，进一步降低铜宗浓度而延长处理时间。测试了铜宗浓度（0.14%、0. 12% 及0.1%)与处理时间（7周及9周）的研宄，最多每周一次正常食物/转胶补充。然而，所 有数据显示，在各种喂食铜宗的制度下，FVB品系小鼠（8周龄，体重28. 5±3克）具有较少 组织学脱髓鞘作用。不选择该FVB系作为这种研宄模型初步开发的特别优选实施方案。虽 然FVB品系有益于成像，且对铜宗毒性敏感，但是体重减轻可能引入混淆变量，通过使用其 它品系，可在这些初步研宄中容易地避免该变量。
[0213] 在其它品系中，MBP 5k-luci 171系（B6C3)小鼠（8周龄，体重25±3克）呈现明 显组织学脱髓鞘作用。
[0214] 在6周0. 2%铜宗处理的末期收取小鼠脑部组织。所有7只铜宗处理小鼠在胼胝 体区域具有明显脱髓鞘作用，而所有3只对照小鼠在胼胝体区域呈现正常髓鞘形成。这些 来自MBP 5K-luci 171系的数据提供了成像信号追随铜宗引发的脱髓鞘作用期的进一步 证据。
[0215] 另外的勒克司坚牢蓝定量分析（图14)证实，在第4周时与B6C3H 171系杂合小 鼠（8周龄，体重25. 5±3克）相比，髓鞘碱性蛋白荧光素酶B6C3 171系纯合小鼠（8周龄， 体重21±3克）呈现更一致及稍微更严重的脱髓鞘作用。在椭圆形的较致密区中显示染色 的髓鞘。
[0216] 此外，喂食0· 2%铜宗的C57BI/6品系野生型雄性小鼠（8周龄，体重20±3克）呈 现最严重及一致的脱髓鞘作用。将C57 BL/6品系用作在初步研宄中描述的铜宗模型及过 氧化物酶体增生物活化受体δ试验化合物功效的正对照系。
[0217] 1.髓鞘碱性蛋白荧光素酶小鼠确认过氧化物酶体增生物活化受体δ选择性激动 剂工具化合物对中枢神经系统髓鞘再生的正向功效
[0218] 将髓鞘碱性蛋白荧光素酶小鼠用于评价是否可使用这种体内生物成像模型检测 过氧化物酶体增生物活化受体S (PPAR δ )激动剂工具化合物（' 571)对中枢神经系统髓鞘 再生的功效。
[0219] 过氧化物酶体增生物活化受体（PPAR)属于核受体超级家族，其功能为调节目标 基因表达的转录因子。与其它转录因子相反，核受体的活性可通过与轻易穿透生物膜的对 应的小配体亲脂分子结合而调节。尽管核受体家族的细胞信号途径复杂，但是使用核受体 作为药物靶标已有漫长成功历史。过氧化物酶体增生物活化受体在细胞分化、发育及代谢 的调节中扮演重要角色。迄今为止，已经发现过氧化物酶体增生物活化受体具有三种由单 独基因编码的密切相关的同工型，一般称为：过氧化物酶体增生物活化受体α、过氧化物 酶体增生物活化受体γ及过氧化物酶体增生物活化受体δ，也称为过氧化物酶体增生物 活化受体 β (J. Berger and D. Ε. Miller, Annu. Rev. Med.，2002, 53, 409-435)。每一受体亚 型具有特征脱氧核糖核酸结合域（DBD)及配体结合域（LBD)，二者对于配体活化基因表达 是必须的。过氧化物酶体增生物活化受体与类视色素 X受体（RXR)结合为异二聚体。
[0220] 过氧化物酶体增生物活化受体δ似乎在中枢神经系统中显著表达；然而，它的许 多功能仍未确定。然而，异常有趣的是发现，过氧化物酶体增生物活化受体S在啮齿动物 少突神经胶质细胞（中枢神经系统的主要脂质产生细胞）中表达（J. Granneman等.，J. Neurosci. Res.，1998, 51，563-573)。此外还发现，过氧化物酶体增生物活化受体δ选择性 激动剂在小鼠培养物中显著增加少突神经胶质细胞的髓鞘基因表达与髓鞘直径（I. Saluja et al.，Glia, 2001，33, 194-204)。过氧化物酶体增生物活化受体δ敲除小鼠具有整体较 小的脑部尺寸，和在白质中降低的髓鞘形成水平（Mol cell Biology 20020:5119)。此外， 过氧化物酶体增生物活化受体S激动剂在多发性硬化的实验性自身免疫脑脊髓炎（EAE) 模型中发挥保护效果（Polak et al·，J Neuroimmunology 2005 168:65-75)。
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