hern analysis)，用相同探针确认髓鞘碱性蛋白的细菌人工染色体 (使用EcoRI切割7. 6K片段，和/或以BamHI切割13. 8K片段）。
[0141] 将用引物组（MBP_L_SP25-gggggatccacctgggacgtagcttttgctg 及 MBP-AP1 5-ggggtttaaactccggaagctgctgtggg)(SEQIDNos·3及4)通过高保真聚合酶链反应扩增 的含有組至114(101()的"长段"髓鞘碱性蛋白启动子克隆入1鮮;[1：1'(^11'8 11-1：(^0载 体，产生中间载体（Topo MBP IOk载体）。然后将髓鞘碱性蛋白IOk启动子（BamHl及PmeI 片段）插入至pGL3hygro neo载体（BglII及PmeI位置）中。将该最终10K载体称为 pGL3-hygro_long MBP-Iuci (参见例如图 4)。
[0142] 将用引物组（MBP_S_SP25-gggggatccatccctggatgcctcagaagag 及 MBP-AP1 5-ggggtttaaactccggaagctgctgtggg)(SEQIDNos·5及6)通过高保真聚合酶链反应扩增的 含有Ml至M3(5K)的"短段"髓鞘碱性蛋白启动子克隆入Invitrogen's p2. Ι-topo载体中， 产生中间载体（Topo MBP5k载体）。然后将髓鞘碱性蛋白5k启动子（BamHl及PmeI片段）插 入至pGL3hygro neo载体（BglII及PmeI位置）中。将该最终5K载体称为pGL3-hygr〇-short MBP-Iuci (参见例如图3)。
[0143] 来自两种pGL3-hyg〇-MBP质粒的脱氧核糖核酸序列确认M1、M2、M3及M4的读序。 此外，瞬时转染这些质粒至293T细胞中得到可检测的荧光素酶活性。
[0144] 动物处理及转基因小鼠的产生
[0145] 依据联邦指导方针进行所有动物工作。使用三种不同品系的小鼠（FVB、B6C3及 C57BL/6)。在吸入异氟醚（Baxter, Deerfield, IL)麻醉的状态下进行成像；观察小鼠直至 完全复原。
[0146] 如下产生转基因小鼠：用Not I及BamHl酶切割pGL3-hygr〇-MBP10k-luci或 pGL3-hygr〇-MBP5k-luci质粒。然后将含有髓鞘碱性蛋白启动子、荧光素酶及多腺苷酸化信 号的片段凝胶纯化。通过标准原核注射（standard pronuclear injection)至FVB、B6C3 或C57BL/6胚胎中产生转基因小鼠。简而言之，在原核显微注射期间，将髓鞘碱性蛋白荧光 素酶基因盒脱氧核糖核酸直接导入至刚刚受精的小鼠卵中。使用细针将脱氧核糖核酸注射 至源自精子的大型雄性原核中。脱氧核糖核酸倾向于以许多串联排列的拷贝的形式整合在 基因组中的随机位置，经常在发生一次或二次细胞分裂之后。因此，所得的小鼠仅为部分转 基因。如果转基因细胞促成生殖系，那么将产生一些转基因卵或精子，且下一代小鼠将为完 全转基因。
[0147] 使用萤火虫荧光素酶基因特异性引物（聚合酶链反应引物： 5' gaaatgtccgttcggttggcagaagc-3'及 5' ccaaaaccgtgatggaatggaacaaca-3' ) (SEQ ID Nos. 7及8)，通过尾部活检脱氧核糖核酸的聚合酶链反应（PCR)鉴定转基因始祖小鼠及其 转基因第一代子代。
[0148] 使用体内成像系统（IVIS 100 ;Xenogen，Alameda, CA)图像化25个阳性始祖小鼠 的子代，并以脑部成像信号鉴定6个转基因系（2个FVB系及4个B6C3HF1系）。由于在此 实验中没有产生阳性脑部成像的C57BL/6始祖，使一个FVB系与C57BL/6小鼠回交，得到 C57BL/6品系。随后将B6C3171系小鼠互交繁殖，以产生纯合转基因交配对。也使B6C3F1171 系与C57白化系回交。
[0149] 表 1
[0150] 将体内生物发光成像用于筛选髓鞘碱性蛋白荧光素酶系。以异氟醚麻醉第一代小 鼠，并通过尾静脉或皮下注射剂量为250毫克/公斤的荧光素。荧光素注射8分钟后，将小 鼠图像化。以脑部成像信号鉴定6个系（图5, 2个FVB品系：58及121，以及4个B6C3品 系：12、23、85及171)。除了 58系，其它5系在脑白质区呈现体外荧光素酶成像信号。
[0151] 表1显示在出生后不久通过尾部活检聚合酶链反应基因型鉴定的35个转基因脱 氧核糖核酸阳性始祖小鼠的数据。15个脱氧核糖核酸阳性始祖系产生MBP-IOk Iuci，20个 脱氧核糖核酸阳性始祖系产生MBP-5k Iuci。在整个应用中，将转基因及转基因小鼠缩写为 MBP-Iuci0
[0152] 表1 :将髓鞘碱性蛋白荧光素酶转基因小鼠作为6个不同的模型产生，以改善生物 成像应用
[0153]
[0154] 图7及图9显示，髓鞘碱性蛋白荧光素酶生物发光良好地与中枢神经系统亚区和 年龄相关髓鞘形成有关。
[0155] 体外成像与发光计测定
[0156] 在皮下注射荧光素（250毫克/公斤）10分钟后，以二氧化碳对动物施行安乐死， 然后立即对分离出的器官进行体外荧光素酶成像。将解剖的器官置于覆盖塑料片的黑纸 上并以IVIS图像化；在解剖后20至30分钟内仍可检测到强生物发光信号。使用Living Image software (Xenogen Corp.)进行图像分析及生物发光的定量。
[0157] 将组织样品置于含有抑制剂的裂解缓冲液（被动裂解缓冲液 [Promega]及少量全蛋白酶抑制剂混合液[Complete Mini Protease Inhibitor Cocktail, Roche, Indianapolis, IN])中。使用组织均化器将组织均化。以短暂超声处理 进一步均化组织。离心组织匀浆并将澄清的裂解物用于发光计测定。为了发光计测定，依 厂商指示制备焚光素酶测定底物（Luciferase Assay System, Promega)。混合组织勾衆 (20微升）及底物（100微升）（100 μ 1)并在发光计中测量。获取本底发光读数，并从发光 数据扣除背景读数。遵循厂商的规程，使用BCA蛋白质测定试剂盒（BCA Protein Assay Kit (Pierce, Rockford, IL))测定蛋白质浓度。将每一蛋白质裂解物的发光计算为每微克蛋 白质的任意单位的光。
[0158] 铜宗引发的脱髓鞘作用与组织学确证
[0159] 对小鼠施用铜宗4周，导致广泛的胼胝体脱髓鞘作用。铜宗引发的脱髓鞘作用与 显著的小神经胶质细胞增生（microgliosis)及巨细胞募集相关（Bakker and Ludwin, J Neurol Sci 78:125-37, 1987 ；Hiremath et al.,J Neuroimmunol 92:38-49,1998 ； McMahon et al·, J Neuroimmunol 130:32-45,2002)，但不具有最低 T 细胞应答 (Matsushima and Morell, Brain Pathol 11:107-16,2001)。在此模型中髓鞘损伤位置的 一致及可预测的性质使胼胝体髓鞘形成的变化易于量化。这些变化可能由少突胶质细胞祖 细胞的新生髓鞘形成作用造成，然而，由免疫调节机制对末期脱髓鞘的预防作用（Pluchino et al.，Nature 436:266-71，2005)可能是另一可行的解释。
[0160] 如上所述，对多个品系的髓鞘碱性蛋白荧光素酶转基因（MBP-luci Tg)小鼠评价 铜宗引发的脱髓鞘作用/髓鞘再生活动的体内评价值。髓鞘碱性蛋白（MBP)启动子驱动的 荧光素酶（Iuci)的表达允许在表达髓鞘碱性蛋白的转基因（Tg)哺乳动物的脑中体内生物 成像定量髓鞘。例如，该模型可使用在饮食中喂食0.2%铜宗的野生型C57/BL6小鼠。为了 在各种化合物处理后评价髓鞘，先前的模型需要在多个时间点最后牺牲动物。由于需要多 个动物，动物间的差异性是需要额外受试者（更多个体）以达到显著性的一项因素。
[0161] 当通过勒克司坚牢蓝（LFB)组织化学染色评价时，饮食含0. 2%铜宗4周的MBP 5k-luci 171系（B6C3)小鼠在脑部胼胝体中显示突出和显著的脱髓鞘作用。这种脱髓鞘作 用进一步与体内生物成像荧光素酶信号的降低有关。
[0162] 然而，MBP IO-Luci 121系小鼠的FVB品系未呈现可相比的脱髓鞘作用。在FVB 小鼠中进行了额外研宄，试图找出可导致显著脱髓鞘作用的在饮食中铜宗的变化量及铜宗 处理的变化时段的潜在制度。结果显示，在胼胝体中，勒克司坚牢蓝评价仅有中度脱髓鞘作 用。因此，优选开发171系。
[0163] 不同品系对铜宗模型的影响：
[0164] 由于其高繁殖力，常使用FVB/NJ(FVB)品系制造转基因小鼠。而由于它们白色的 相对不吸光毛色，FVB品系小鼠也广泛用于转基因生物成像模型。在FVB或其它品系中，也 可去除毛发（例如通过修剪），从而减少毛发或毛皮的吸收或散射所导致的信号损失。
[0165] 因为在铜宗模型中发现品系间差异，所以品系的选择可影响结果。为特定目的而 选择最佳品系被视为常规优化，例如取决于所选的测定法及设备。然而，制造转基因哺乳动 物不被视为限制因素；而是使用特定品系及转基因系对例如影响髓鞘形成的条件的敏感度 作为改善数据质量的选择标准。取决于所选的髓鞘形成/脱髓鞘作用活动，品系或遗传背 景的选择可能影响结果。据认为，特殊脱髓鞘作用模型在特定品系中可作用更好。如此选 择模型及品系可被视为例行测定开发的一部分。虽然铜宗喂食是研宄脱髓鞘作用与髓鞘再 生的优良模型，但是在品系差异中明显观察到，在这种模型中存在强的遗传因素。
[0166] FVB 品系
[0167] 来自FVB品系的小鼠被选中，部分归因于其白毛色。FVB小鼠提供适于多数转基 因实验及随后基因分析的系统。例如，近交FVB品系的特征在于强繁殖能力及一贯的大窝 (large litters)。这降低产生大种群的成本及力气。而且，已受精FVB卵含有大而明显的 原核，方便显微注射脱氧核糖核酸。此外，该FVB品系具有白化毛色，使其成为生物成像的 首选。这些特色使FVB品系有利于研宄转基因生物成像模型。然而，当其它品系呈现希望 的特征时，可使用其它品系。
[0168] FVB品系小鼠在体重减轻方面对0. 2%铜宗十分敏感。每周需要补充2至3次正 常食物/转胶（transgel)，以避免严重体重减轻及毒性。此外，本发明人的经验显示，在各 种铜宗喂食制度下，FVB品系小鼠呈现最小组织学脱髓鞘作用。
[0169] 因此，将MBP IOk-Iuci 121系（FVB品系）与C57B1/6回交，以促进将来的确证及 应用。
[0170] B6C3/Tac 品系
[0171] B6C3杂交品系可通过以下方法产生：将C57BL/6Ntac雌性小鼠与来自Taconic US' s 商业群（Taconic US' s commercial colonies)的 C3H/HeNTac 雄性小鼠互交。它具 有黑色或野鼠色（agouti)毛色。B6C3将为基因座杂合的，其中C57BL/6与C3H不同，和基 因座纯合的，其中它们相同。
[0172] B6C3/Tac小鼠呈现明显组织学脱髓鞘作用。具体地，与野生型C57BL6相比，在生 物成像模型171系MBP 5k-Luci纯合小鼠中的脱髓鞘作用仅为轻度较不广泛的，差异性轻 微。与C57BL6及171系MBP 5k-Luci纯合小鼠相比，在171系MBP 5k-Luci杂合小鼠中的 脱髓鞘作用被认为较不严重，更局部性和更易变。这些结果说明，髓鞘碱性蛋白荧光素酶模 型可用于测定个体、品系或品种对影响髓鞘形成的活动的敏感性。此外，髓鞘碱性蛋白荧光 素酶结构即使在黑毛哺乳动物中也不失去效用。
[0173] BALB/cJ 品系
[0174] 也调研在BALB/cJ小鼠中铜宗对皮层脱髓鞘作用的影响。在这些小鼠中，皮层脱 髓鞘作用仅为局部性。
[0175] 此外，在BALB/cJ小鼠中，皮层小神经胶质细胞的累积明显增加，而在C57BL/6小 鼠的皮质中无小神经胶质细胞。因此品系的差异性可用于支持不同研宄目的。
[0176] C57BL/6J Jax 品系
[0177] C57BL/6遗传背景的动物适用于许多铜宗模型研宄，并在过去的三十年中已应用 于数个实验室。当8周龄的C57BL/6小鼠在饮食中喂食0. 2%铜宗时，成熟少突神经胶质细 胞被特异性攻击（无法满足大量髓鞘支持的代谢需求）并走向细胞凋亡。紧接着是小神经 胶质细胞的募集及髓鞘吞噬作用。髓鞘基因表达的研宄配合形态学研宄指出，即使面临持 续代谢激发，少突神经胶质细胞的祖细胞增生并侵袭脱髓鞘区域。如果终止铜宗激发，在大 概数周内发生几乎完全的髓鞘再生。可推断，通过可溶性因子在不同细胞类型之间细胞间 通讯。本发明的方法及模型可用于研宄细胞间通讯活动，例如，测定是否有假定因素涉及髓 鞘形成的募集，筛选促进募集的化合物，以及筛选抑制募集的化合物。
[0178] 此外，髓鞘碱性蛋白荧光素酶模型的再现性指出，其可允许测试操作（例如，在共 有遗传背景（common genetic background)上可获得的基因敲除或转基因，或干扰核糖核 酸或药物处理），其可加速或抑制脱髓鞘作用和/或髓鞘再生的过程。
[0179] 髓鞘碱性蛋白荧光素酶模型的改良
[0180] 虽然171系（B6C3H品系，杂合子）已经显示在髓鞘形成/脱髓鞘作用研宄中起作 用，但是可将该模型通过以下方法进一步改良：