21] 先前已经证实，选择性过氧化物酶体增生物活化受体δ激动剂在神经组织中扮 演功能性角色，并刺激少突胶质细胞的祖细胞分化。SARl 17145为口服可生物利用的可穿透 脑的过氧化物酶体增生物活化受体S选择性激动剂，在体外以浓度依赖性形式刺激啮齿 动物及人类少突胶质细胞的祖细胞分化；能够用过氧化物酶体增生物活化受体S选择性 拮抗剂阻断这种功效。
[0222] 在大鼠少突胶质细胞中，髓鞘碱性蛋白表达增加之前为下游过氧化物酶体增生物 活化受体靶标Angptl4的信使核糖核酸表达增加，且此上调作用被过氧化物酶体增生物活 化受体δ的慢病毒短发夹核糖核酸（shRNA)敲下而阻断。在急性脱髓鞘作用的小鼠铜 宗模型中，其中小鼠被喂食2%铜宗饮食达4周，SAR117145增强中枢神经系统髓鞘再生， 增加 Angptl4的信使核糖核酸表达，并增进胼胝体的轴突传导。Angptl4的中枢神经系统 活化作用伴随腓肠肌表达增加，暗示这可作为潜在替代标志物。这些数据证实，过氧化物 酶体增生物活化受体δ激动剂可增强中枢神经系统髓鞘再生与增进轴突功能，并暗示它 们用于治疗脱髓鞘障碍在刺激内源性修复过程中的潜在用途（US Patent application 20070149580, USE OF PEROXISOME PR0LIFERAT0R ACTIVATED RECEPTOR DELTA AGONISTS FOR THE TREATMENT OF MS AND OTHER DEMYELINATING DISEASES)。
[0223] 在B6C3H 171系杂合小鼠中测试了过氧化物酶体增生物活化受体δ激动剂工具 化合物（'517 ;图15)。将8周龄小鼠用含有0. 2 %铜宗的饮食处理4周，然后给予正常饮食 使髓鞘再生。然后将小鼠每日二次口服媒介物（0.6%羧甲基纤维素钠盐与0.5%吐温80) 或30毫克/公斤的过氧化物酶体增生物活化受体δ激动剂工具化合物' 517达8日，并在 图中指定的时间点图像化。将数据标准化至零周的基线信号。与媒介物组（η = 13)相比， 在工具化合物' 517组（η = 15)中具有30-100%的相对荧光素酶信号增加，我们认为这归 因于少突胶质细胞的祖细胞分化作用的增进。
[0224] 在相同研宄中，通过勒克司坚牢蓝（LFB)染色进一步组织学确认' 517的功效（图 16)。将来自福尔马林固定石蜡包埋的脑部矢状窦旁组织切片用勒克司坚牢蓝染色，用于定 性评价胼胝体中的髓鞘。对每一时间点的染色切片进行评分及分级，等级为〇 (完全髓鞘形 成）至5(完全脱髓鞘）。评分系统如下：0=正常髓鞘，无脱髓鞘作用；1 =最小局部脱髓 鞘；2 =轻至中度局部脱髓鞘；3 =中度局部广泛性脱髓鞘；4 =严重局部广泛性脱髓鞘；5 =严重扩散性脱髓鞘。在4周铜宗处理后，来自小鼠的勒克司坚牢蓝染色脑切片的组织学 评价证实171系杂合小鼠 （η = 5)中的胼胝体的中度至严重脱髓鞘作用。工具化合物' 517 组（η = 5)与媒介物对照组（η = 3)相比，在髓鞘再生期间从第4周至第5周用'517处 理导致如通过勒克司坚牢蓝在第7周的时间点所测的可测量的髓鞘增加。尽管实验个体 数量少，但是组织学数据支持体内荧光素酶生物成像的数据，显示当与媒介物对照相比时， 用' 517化合物处理的小鼠的髓鞘再生增加。
[0225] 171系杂合小鼠的第二项PPAR δ 517研宄显示类似结果（未显示数据，并同样 延长' 517处理至3周）。与第一项研宄（图15) -致，第二项研宄也表明，'517在髓 鞘再生过程的早期恢复阶段加速少突胶质细胞的祖细胞分化（Μ Lindner and S Heine 等，Neuropathology and Applied Neurobiology, 34, 105-114, 2008)〇
[0226] 2.髓鞘碱性蛋白荧光素酶小鼠检测雌激素受体β激动剂' 5a，或正对照化合物喹 硫平对髓鞘表达的保护性功效。
[0227] 雌激素受体（ER)属于类固醇核受体家族，通过特异性应答元件直接作用于脱氧 核糖核酸，并调苄基因表达。雌激素受体有两种亚型一雌激素受体α及雌激素受体β。雌 激素受体α在子宫、前列腺、卵巢、骨、乳房及脑中高度表达，而雌激素受体β存在于结肠、 前列腺、卵巢、骨髓及脑中。雌激素受体β的选择性靶向作用是具有吸引力的治疗方法，以 避免雌激素受体α的副作用。已鉴定出雌激素受体亚型的选择性化合物。
[0228] 例如，雌激素受体β (非雌激素受体α )激动剂已显示可体外保护少突胶质细胞 及成神经瘤细胞免于细胞凋亡。此外，雌激素受体β或雌激素受体激动剂改善实验性自身 免疫脑脊髓炎，并具有保护神经功效（保护髓鞘与轴突）。基于先前的过氧化物酶体增生 物活化受体S激动剂工具化合物'517,在铜宗模型中使用髓鞘碱性蛋白荧光素酶系分析 雌激素受体β激动剂'5a。而且，我们囊括AstraZeneca的精神分裂症药物喹硫平（10毫 克/公斤，口服，每日一次）作为正对照，基于喹硫平对铜宗引发的脱髓鞘作用的保护功效 (Schizophrenia Research，2008，Dec 106,182-91)。使用 B6CH 171 系杂合小鼠进行两项 独立研宄。
[0229] 第一项研宄（图17)显示，雌激素受体β激动剂' 5a及正对照喹硫平（QTP)在铜 宗模型脱髓鞘作用期间是保护性的。将髓鞘碱性蛋白荧光素酶171系杂合B6C3H小鼠喂食 铜宗饮食4周，并口服'5a(10毫克/公斤，η = 12,或30毫克/公斤，η = 16)或喹硫平 (10毫克/公斤，η= 14)。将小鼠在第0周（基线）、第3周及第4周图像化。将数据标准 化至第0周的基线。与先前研宄（图15)类似，媒介物组导致49% (第3周）与45% (第 4周）生物成像信号降低。对于第3周及第4周的时间点，在10毫克/公斤，与媒介物对照 相比，喹硫平组呈现显著成像信号增加。喹硫平处理组的结果与Zhang等人发表的数据一 致（Schizophrenia Research, 2008, Dec 106, 182-91)。30 晕克 / 公斤的化合物 ' 5a 在第 4周显示超过媒介物的显著增加，但10毫克/公斤的化合物' 5a在第3周或第4周与媒介 物无显著差别。这些结果表明，髓鞘碱性蛋白荧光素酶成像模型可用于评价在铜宗模型中 的剂量依赖性保护功效。
[0230] 设计进一步研宄（图18)，以确认第一项研宄的结果（图17)，但是媒介物及30毫 克/公斤' 5a化合物处理组具有更大的组群。与第一项研宄结果一致，当与媒介物处理对 照组（η = 25)相比时，用10毫克/公斤喹硫平处理的小鼠 （η = 17)产生对铜宗引发的信 号降低的统计上显著的抑制作用，时间点为第3周（25%对比47%降低，ρ = 0. 028)及第 4周（6%增加对比25%降低）。此外，与媒介物对照组相比，30毫克/公斤的'5a(N = 27) 造成显著较强的转基因活性，时间点为第3周（31%对比47%降低，p = 0. 0079)及第4周 (6%降低对比25%降低，p = 0. 0015)。
[0231] 这两项研宄证实，30毫克/公斤的' 5a明显防止在中枢神经系统中由铜宗饮食引 发的生物成像信号降低，尽管未达到与10毫克/公斤的正对照喹硫平相同的程度（在这些 实验中使用的条件下）。由于先前的研宄已经证实了在中枢神经系统髓鞘形成程度与髓鞘 碱性蛋白荧光素酶生物成像信号之间的直接关系，这些目前的结果表明，'5a及喹硫平都防 止在铜宗饮食给药期间中枢神经系统的脱髓鞘作用。成像模型的数据支持' 5a及喹硫平都 减弱铜宗引发的脑部脱髓鞘作用与髓鞘破坏。
[0232] 3.在铜宗模型中髓鞘碱性蛋白荧光素酶系的比较
[0233] 制成在各种品系背景上的6个转基因系，用于不同的生物成像应用。
[0234] 比较在铜宗模型中B6C3H 171系纯合及杂合小鼠的成像信号（图19)。纯合子中 的两个报道基因拷贝在脱髓鞘作用期呈现超过2倍的信号降低，及在髓鞘再生期呈现2倍 信号增加。尽管已经证实，杂合171系（B6C3H品系）在铜宗模型中起作用并可检测化合物 功效，但是预期可通过繁殖成纯合体型而进一步改善模型以增强生物成像信号强度。由于 可将小鼠群落维持为纯合子，这也简化模型生产，并降低基因分型成本。此外，成像窗越大， 模型检测化合物引发的变化就越灵敏。
[0235] 图20显示在铜宗模型中来自三个不同系的组织学勒克司坚牢蓝数据的比较。定 量勒克司坚牢蓝数据证实了 171系B6C3H的生物成像结果，纯合小鼠呈现最严重的铜宗引 发的脱髓鞘作用；严重度类似于对通常使用的野生型C57BL/6小鼠品系所观察到的严重 度。171系杂合小鼠呈现较不严重的脱髓鞘作用，而这些171系杂合小鼠呈现最少量的铜宗 引发的脱髓鞘作用。
[0236] 在图21中证实，具有最大生物成像信号降低的髓鞘碱性蛋白荧光素酶系也具有 最大脱髓鞘作用，如通过组织学评价。通过生物成像及勒克司坚牢蓝（LFB，髓鞘染色）组织 学比较三种不同髓鞘碱性蛋白荧光素酶系（171系B6C3H杂合品系、121系C57BL/6杂合品 系及171系B6C3H纯合品系）。将小鼠用含有0.2%铜宗的饮食处理4周或5周。将成像 数据标准化至第〇周的基线测量值。在每一研宄结束时，收取小鼠脑并将连续石蜡切片用 勒克司坚牢蓝针对髓鞘染色。平均定性的勒克司坚牢蓝评分（〇至5)显示在图21的图表 中。171系B6C3H纯合小鼠呈现最大成像信号降低，也证实最严重脱髓鞘作用，如通过定性 组织学分析所评价。171系B6C3H杂合小鼠呈现最小成像窗，也在第4周呈现最少组织学脱 髓鞘作用。参考在喂食铜宗饮食之前的基线成像，171系B6C3H纯合小鼠在喂食铜宗饮食期 间具有最大生物成像信号降低。例如，在铜宗饮食3周后，171系B6C3H纯合小鼠具有72% 信号降低（第3周参考第0周，p〈0. 05)，而171系B6C3H杂合小鼠具有45%生物成像信号 降低（参考第〇周，P〈〇. 05)。121系C57BL/6杂合小鼠具有最小降低的荧光素酶信号（第 3周相对于第0周降低33%，p〈0. 05)。
[0237] 通过用喹硫平（10毫克/公斤）处理171系B6C3H纯合小鼠，进一步证实髓鞘碱 性蛋白荧光素酶模型的灵敏度及应答性，显示在图22中。与使用171系B6C3H杂合小鼠的 结果（图17及18) -致，喹硫平（10毫克/公斤）显著防止生物成像信号降低。基于这些 结果，将171系纯合小鼠认定为用于铜宗引发的脱髓鞘作用生物成像模型的最佳系。
[0238] 4.髓鞘碱性蛋白荧光素酶模型的其它应用
[0239] 髓鞘碱性蛋白荧光素酶小鼠具有脑部与脊髓荧光素酶的表达。如图23中所示，发 光信号主要来自脑部与脊髓的白质区。除了已经成功示范用于铜宗模型的来自脑部的荧光 素酶成像之外，来自脊髓的荧光素酶成像信号可用于多发性硬化的实验性自身免疫脑脊髓 炎（EAE)模型中，或应用为脊髓模型。
【主权项】
1. 监测在活体生物中脱髓鞘作用或髓鞘再生的方法，所述方法包括： 转基因修饰所述生物，以表达通过髓鞘碱性蛋白（MBP)启动子驱动的荧光素酶基因； 监测来自所述生物的生物发光；及 将所述光输出与所述生物的身体的特定部分相关联。2. 转基因生物，其含有通过髓鞘碱性蛋白（MBP)启动子驱动的荧光素酶基因。3. 如权利要求2的转基因生物，其中所述生物为小鼠。4. 表达荧光素酶基因的转基因生物，所述荧光素酶基因在髓鞘碱性蛋白（MBP)启动子 的控制之下。5. 如权利要求4的转基因生物，其中所述髓鞘碱性蛋白启动子包含Ml至M4或Ml至 M3 〇6. 开发生物成像品系的方法，包括： (1) 选择一个系，其中在出生后髓鞘形成高峰时的体内全小鼠成像呈现中枢神经系统 特异性成像； (2) 选择一个系，其中体外成像确认荧光素酶转基因表达主要在脑或脊髓的白质区； (3) 选择一个系，其中荧光素酶图像强度与在脱髓鞘作用模型中引发的脱髓鞘作用及 髓鞘再生的变化高度相关；及 (4) 选择一个系，其作为模型呈现清楚的组织学脱髓鞘作用。7. 如权利要求6的方法，其中所述出生后髓鞘形成的高峰是约3-5周的第一代小鼠。8. 如权利要求6的方法，其中所述模型是铜宗脱髓鞘作用模型。9. 监测髓鞘形成的改良方法，所述改良包括成像表达髓鞘碱性蛋白荧光素酶的转基因 动物。10. 降低髓鞘形成研宄中的差异性的方法，所述方法包括在至少两个不同的时间点监 测动物中的髓鞘碱性蛋白控制的荧光素酶。
【专利摘要】本发明涉及在髓鞘碱性蛋白启动子的控制下表达荧光素酶(MBP-LUCI)的动物模型和所述模型用于生物发光体内成像的用途。具体地使用与萤火虫荧光素酶报道基因偶联的髓鞘碱性蛋白(MBP)启动子产生表达荧光素酶的转基因动物。髓鞘碱性蛋白荧光素酶生物成像模型提供了监测髓鞘形成状态及调节髓鞘再生的试验化合物的功效的方法。生物成像的优点为，受试者在纵向研究中可作为自己的对照。可历经至少10周持续追踪相同受试者的脱髓鞘作用及髓鞘再生过程。这种模型使得能够标准化个别动物成像应答，并提供大量降低差异性的优质数据。此外，由于不需要在不同时间点牺牲动物组群，可减少化合物功效研究所需的数量。
【IPC分类】A01K67/027, C12N15/85
【公开号】CN104975042
【申请号】CN201510329785
【发明人】J.曹, K.钱德罗斯, K.D.埃科诺米德斯, H.G.波利特斯, D.温斯托克, 应晓优
【申请人】赛诺菲
【公开日】2015年10月14日
【申请日】2010年12月3日
【公告号】CA2784652A1, CN102770020A, CN102770020B, EP2512227A1, US20130117868, WO2011084281A1