一种利用鳕鱼鱼肉制造ace抑制肽的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及食品深加工领域，特别涉及鳕鱼鱼肉的深加工。
【背景技术】
[0002] 高血压作为一种多病因、进展性心血管疾病，临床表现全身主动血压升高，患者的 收缩压> 140mmHg，舒张压>90mmHg。随着病情的发展，血压持续升高，继而出现心、脑、肾 和视网膜等器官损伤，导致充血性心力衰竭、脑卒中、冠心病、肾功能衰竭、主动脉瘤的发病 率和病死率升高。高血压是一种患病率极高的疾病，已成为全球范围内的重大公共卫生问 题。据国际高血压学会发表的新闻公报，全球高血压或血压偏高人群已有9. 72亿人，约占 世界成年人口的26. 4%。世界卫生组织（WHO)对全球各种疾病的死亡统计，以高血压等为 代表的心脑血管疾病死亡人数占总死亡人数的比例将由1997年的28. 8%上升至2002年的 36.0%。我国高血压流行病学调查结果显示，
[0003] 目前用于高血压治疗的药物主要有六大类：分别是利尿降压药、β -受体阻滞剂、 钙拮抗剂、血管紧张素转化酶抑制剂（ACEI)、血管紧张素 II受体拮抗剂（ARB)和α 1-受体 阻滞剂。这些药物在高血压的治疗中取得了很好的效果。其中血管紧张素转化酶抑制剂是 唯一拥有全部6个强适应证（心力衰竭、心肌梗死、冠心病高危因素、糖尿病、慢性肾病、预 防中风复发）的一线抗高血压药物。ACEI在肾性高血压、慢性肾小球肾炎、慢性肾功能衰竭 及治疗预防糖尿病肾病的作用上已得到肯定。
[0004] ACE抑制肽指的是一类具有ACE抑制活性的多肽。这些多肽的氨基酸序列和肽链 长度各有不同，但都具有类似的活性。ACE具有两个活性部位，分别名为N-区、C-区，这两个 活性区域具有类似的功能，只是对不同底物的亲和力有所不同。ACE抑制肽对ACE的结合， 抑制管紧张素 I，从而阻碍ACE催化血管紧张素 I水解成为血管紧张素 II，从而起到降血压 作用。目前，许多研究表明食品中的一些短肽存在降血压作用。人们已经从许多食品来源 的材料中发现了 ACE抑制肽。从来源上，食源ACE抑制肽可分为三类：来自乳蛋白的肽类， 包括乳酪蛋白、乳球蛋白和乳清蛋白；来自植物蛋白的肽类，如大米多肽、大豆多肽、玉米多 肽等；来自鱼贝类的肽类，如罗非鱼多肽、带鱼多肽、金枪鱼多肽、沙丁鱼多肽、南极磷虾多 肽等。虽然这些ACE抑制肽的降压效果没有合成药物强烈，但是它们具有安全、无毒副作用 的特点吸引了众多研究者。从天然食品蛋白中发现的短链ACE抑制肽，不仅体外实验证明 对ACE有较强的抑制活性，动物实验和人体临床实验的降血压效果也十分令人振奋。这为 通过功能食品预防和缓解高血压提供了新的途径。
[0005] 鳕鱼主要分布于北太平洋，北大西洋两侧的一般栖于近底层，由近岸带到深海区， 在中国主要分布于渤海、黄海和东海北部。黄海北部、山东高角东南偏东和海洋岛南部及东 南海区有主要的渔场。鳕鱼肉质白细鲜嫩，清口不腻、世界上不少国家把鳕鱼作为主要食用 鱼类。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种使用鳕鱼鱼肉制备ACE抑制肽的方法。
[0007] 本发明所采取的技术方案是：
[0008] 利用鳕鱼鱼肉制造 ACE抑制肽的方法，包括如下步骤：
[0009] 1)将鳕鱼鱼肉洗净，加入水，匀浆处理之后加热将酶灭活，得到浆液A ;
[0010] 2)将浆液A冷却至不高于60°C，加入蛋白酶酶解，得到酶解液；
[0011] 3)将酶解液离心，收集上清液A ;
[0012] 4)在上清液A中加入碳酸钙，混匀，过滤得到澄清的上清液B ;
[0013] 5)使用截留分子量3000Da的中空纤维超滤装置超滤，收集滤液，干燥得到ACE抑 制肽。
[0014] 作为本发明的进一步优化，将上清液A加热以使其中的蛋白酶灭活。
[0015] 作为本发明的进一步优化，干燥得到的ACE抑制肽进一步经过Sephadex G-15和 RP-HPLC两步分离纯化得到高纯度的ACE抑制肽。
[0016] 作为本发明的进一步优化，匀浆处理之后加热至90°C保温至少lOmin，以将酶灭 活。
[0017] 作为本发明的进一步优化，将浆液A冷却至45~55 °C，调节其pH至7. 5~8. 5， 之后加入蛋白酶酶解。
[0018] 作为本发明的进一步优化，鳕鱼鱼肉与水的质量比为1 : 3。
[0019] 作为本发明的进一步优化，碳酸钙的加入量为上清液A质量的10%。
[0020] 作为本发明的进一步优化，蛋白酶的酶解时间为120~240min。
[0021] 本发明的有益效果是：
[0022] 本发明方法可以将低价值的鳕鱼鱼肉转化为具有较高价值的ACE抑制肽，变废为 宝，充分利用了资源。
[0023] 本发明方法工艺路线简单易行，操作简单，所使用的设备为成熟设备，投资成本较 低，ACE抑制肽回收率高。
[0024] 经过S印hadex G-15和RP-HPLC两步分离纯化得到高纯度的ACE抑制肽，具有极 好的生物活性，其抑制ACE的IC5tl值为10. 7 μ M。
【具体实施方式】
[0025] 利用鳕鱼鱼肉制造 ACE抑制肽的方法，包括如下步骤：
[0026] 1)将鳕鱼鱼肉洗净，加入水，匀浆处理之后加热将酶灭活，得到浆液A ;
[0027] 2)将浆液A冷却至不高于60°C，加入蛋白酶酶解，得到酶解液；
[0028] 3)将酶解液离心，收集上清液A ;
[0029] 4)在上清液A中加入碳酸钙，混匀，过滤得到澄清的上清液B ;
[0030] 5)使用截留分子量3000Da的中空纤维超滤装置超滤，收集滤液，干燥得到ACE抑 制肽。
[0031] 作为本发明的进一步优化，将上清液A加热以使其中的蛋白酶灭活。当然，也可以 根据需要，使用其.他公知方法将其中的酶灭活。
[0032] 作为本发明的进一步优化，干燥得到的ACE抑制肽进一步经过Sephadex G-15和 RP-HPLC两步分离纯化得到高纯度的ACE抑制肽。
[0033] 作为本发明的进一步优化，匀浆处理之后加热至90°C保温至少lOmin，以将酶灭 活。当然，也可以根据需要，使用其他公知方法将其中的酶灭活。
[0034] 作为本发明的进一步优化，将浆液A冷却至45~55°C，调节其pH至7. 5~8. 5， 之后加入蛋白酶酶解。
[0035] 作为本发明的进一步优化，鳕鱼鱼肉与水混合，是为了方便匀浆损伤，其质量比可 以根据需要进行调整，特别的，当其质量比为1 : 3,可以有效地减少水的用量，同时，对肽 的制备不利影响也比较小。
[0036] 作为本发明的进一步优化，碳酸钙的加入量为上清液A质量的10%。
[0037] 作为本发明的进一步优化，蛋白酶的酶解时间为120~240min。当然，根据所使用 的酶和酶解温度的不同，也可以进行适当的缩短或延长。
[0038] 下面结合实施例，进一步说明本发明。
[0039] 实施例1鳕鱼鱼肉的酶解和ACE抑制肽的富集
[0040] 1)原料的处理：称取IOOkg鳕鱼鱼肉，洗干净后，加入300L去离子水，在打浆机中 进行打浆处理后，煮沸20min，灭活自身酶系；
[0041] 2)酶解鳕鱼鱼肉：待鳕鱼鱼肉浆液，冷却至55°C，调pH至8.0,加入入碱性蛋白酶 Alcalasel50g，酶解3hr，得到酶解液；
[0042] 3)灭活碱性蛋白酶Alcalase :将酶解液升温至95°C，保温IOmin,灭活酶解液中的 碱性蛋白酶Alcalase ;
[0043] 4)酶解液的预处理：将灭酶后的酶解液冷却至室温，采用管式离心机，于3000rpm 下离心，收集上清液；
[0044] 5)酶解液的澄清：在离心收集的上清液中加入10%轻质碳酸钙，板框过滤后得到 澄清、含ACE抑制肽的清液；
[0045] 6)大分子物质的去除：采用截留分子量3000Da的中空纤维超滤装置，超滤去除含 ACE抑制肽的清液中的大分子物质，收集含ACE抑制肽的滤液；
[0046] 7) ACE抑制肽的干燥：将滤液喷雾干燥，即得到ACE抑制肽。
[0047] 实施例2高纯度ACE抑制肽的制备
[0048] 采用S印hadex G-15分离粗品ACE抑制肽粉末的ACE抑制肽，凝胶柱，I. 8 X 60cm ; 样品浓度，50mg / ml;上样量，1.5ml ;流速，0.4ml / min;洗脱剂，0.02mol / L HAc-NaAc 缓冲液（pH4. 0);得到7个组分，其中组分E的活性较高；
[0049] 表1Sephadex G-15分离酶解产物所得组分的ACE抑制活性
[0050]
[0051] 利用 RP-HPLC 对组分 E 进行纯化，使用 Kromasil C18 12 μ m ST4. 6 / 250 (4. 6 X 250mm)色谱柱分离得到16个组分，其中组分FlO具有较高的ACE抑制活性，对纯 化得到的单一活性组分FlO进行经氨基酸组成分析和鉴定，从鳕鱼鱼肉Alcalase酶解物中 分离出一种新的ACE抑制肽LPP，其IC5tl值为10. 7 μ M。
【主权项】
1. 利用鳕鱼鱼肉制造ACE抑制肽的方法，包括如下步骤： 1) 将鳕鱼鱼肉洗净，加入水，匀浆处理之后加热将酶灭活，得到浆液A ; 2) 将浆液A冷却至不高于60°C，加入蛋白酶酶解，得到酶解液； 3) 将酶解液离心，收集上清液A ; 4) 在上清液A中加入碳酸钙，混匀，过滤得到澄清的上清液B ; 5) 使用截留分子量3000Da的中空纤维超滤装置超滤，收集滤液，干燥得到ACE抑制肽。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：将上清液A加热以使其中的蛋白酶灭活。3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：匀浆处理之后加热至90°C保温至少 lOmin，以将酶灭活。4. 根据权利要求1~3任意一项所述的方法，其特征在于：将楽液A冷却至45~55°C， 调节其pH至7. 5~8. 5,之后加入蛋白酶酶解。5. 根据权利要求1~4任意一项所述的方法，其特征在于：鳕鱼鱼肉与水的质量比为 1 : 3〇6. 根据权利要求1~5任意一项所述的方法，其特征在于：蛋白酶为碱性蛋白酶 Alcalase07. 根据权利要求1~6任意一项所述的方法，其特征在于：碳酸钙的加入量为上清液A 质量的10%。8. 根据权利要求1~7任意一项所述的方法，其特征在于：蛋白酶的酶解时间为120~ 240min〇9. 根据权利要求1~8任意一项所述的方法，其特征在于：干燥得到的ACE抑制肽进 一步经过Sephadex G-15和RP-HPLC两步分离纯化得到高纯度的ACE抑制肽。
【专利摘要】本发明公开了一种利用鳕鱼鱼肉制造ACE抑制肽的方法，通过将鳕鱼鱼肉洗净与水混合，匀浆，酶解，板框过滤，超滤截留3000Da以下小分子，干燥后得到ACE抑制肽。进一步使用Sephadex G-15和RP-HPLC两步分离纯化可以得到高纯度的ACE抑制肽。本发明方法可以将低价值的鳕鱼鱼肉转化为具有较高价值的ACE抑制肽，变废为宝，充分利用了资源，具有工艺路线简单易行，操作简单，所使用的设备为成熟设备，投资成本较低，ACE抑制肽回收率高。
【IPC分类】C07K1/20, A61P9/12, C12P21/06, C07K1/16
【公开号】CN104975059
【申请号】CN201410138184
【发明人】朱威, 雷楗勇, 贺雄雷, 潘武广, 郭蕾
【申请人】广州世优生物科技有限公司
【公开日】2015年10月14日
【申请日】2014年4月8日