一种提高真菌产巴卡亭iii产率的氧化环境发酵方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于真菌培育技术领域，具体涉及一种提高真菌产巴卡亭III产率的氧化 环境发酵方法。
【背景技术】
[0002] 紫杉醇被广泛用于癌症的化疗，尤其是对乳腺癌、子宫癌和卵巢癌等女性高发癌 症具有良好的效果，但是其人工合成工艺复杂，所以依然不能依靠人工合成生产。目前，医 用紫杉醇提取自红豆杉，然而紫杉醇在红豆杉中含量极低，同时红豆杉生长极其缓慢，但紫 杉醇前体物巴卡廷ΠΙ或10-去乙酰巴卡廷III含量较高，因此，通过巴卡廷III或10-去 乙酰巴卡廷III人工半合成获得紫杉醇是当今该药的主要途径。尽管红豆杉中巴卡廷III 或10-去乙酰巴卡廷III含量较之紫杉醇高，但依然不能满足市场需求，导致紫杉醇价格依 然昂贵，不能充分满足市场需求。因此，如何快速生产巴卡廷III或10-去乙酰巴卡廷III 成为影响紫杉醇市场价格的主要因素。
[0003] 近年来，分离自红豆杉的一些内生菌被发现能够产生巴卡廷III或10-去乙酰巴 卡廷III，这为通过发酵手段生产紫杉醇前提物提供了现实基础，但是，相比较红豆杉中巴 卡廷III或10-去乙酰巴卡廷III的含量，内生菌发酵的产生较低，因此，如何通过适当的 手段来提高其发酵产量成为这些内生菌能否应用到生产的关键。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种提高真菌产巴卡亭III产率的氧化环境发酵方法，解决 了现有技术中存在的发酵法产巴卡廷III产率较低的问题。
[0005] 本发明所采用的技术方案是，一种提高真菌产巴卡亭III产率的氧化环境发 酵方法，包括以下步骤：在液体培养基中培养产巴卡廷III的红豆杉内生菌，Diaporthe phaseolorum的菌株no. 79,当真菌在培养基中培养一段时间后，第一次加入双氧水，然后 每隔3天添加一次双氧水，直至发酵结束，得到真菌培养液，并对真菌培养液进行回收和提 纯。
[0006] 本发明的特点还在于，
[0007] 培养基为PDB培养基，其组成为：水1000ml、马铃薯600g、蔗糖280g、pH 6. 5-7. 0。
[0008] 培养一段时间的具体时间长度是2天。
[0009] 第一次加入双氧水的量为每1000 ml培养基中加入30ml双氧水。
[0010] 每隔三天加入双氧水的量为每1000 ml培养基中加入60ml双氧水。
[0011] 回收并提纯巴卡廷III的步骤包括：
[0012] 1)真菌培养液用滤纸过滤备用，菌丝体残渣加入石英砂被充分研磨，研磨的后的 残渣在45°C条件下被充分干燥，然后称重备用；
[0013] 2)将干燥称重后的菌丝体粉末放入30ml体积比为1:1的氯仿/甲醇混合液，充分 混匀为悬浊液，然后在超声波震荡30分钟，过滤，将滤渣采用上述方法提取；
[0014] 3)合并两次所得滤液并在40°C条件下低压旋转蒸发，然后将所的到的膏状蒸发 残留物溶解在30ml氯仿中，然后用30ml的水再次抽提；
[0015] 4)收集有机相，并在旋转蒸发器中40°C旋转蒸发，所得干燥残留物被溶解在5ml 的甲醇中，并用〇.451m孔过滤器过滤备用；
[0016] 5)过滤后的真菌培养液在70°C条件下低真空旋转蒸发；
[0017] 6)当液体剩余IOml左右时，加入30ml体积比为1:1的氯仿/甲醇混合液，然后使 用和菌丝体相同的方法进行巴卡廷III的分离。
[0018] 本发明的有益效果是：本发明通过添加一定量的过氧化氢来培养一株产巴卡廷 III的红豆杉内生菌，使其巴卡廷III的产量显著提高，达到原来对照产量的1. 8倍。
[0019] 本发明在对产巴卡廷III内生菌培养过程中，通过添加一定量的过氧化氢溶液， 从而明显地提高了巴卡廷的产率，方法简便，容易操作。本发明添加过氧化氢创造了内生菌 培养的氧化环境，从而促进了其次生代谢产物巴卡廷III的增加，所添加试剂在提取过程 中会自动分解，不存在在有毒残留，成本低。
【附图说明】
[0020] 图1是本发明显示的是红豆杉内生菌Diaporthe phaseolorum的菌株no. 79的菌 落形态和分生孢子形态。
[0021] 其中，A)是生长15天后菌落的形态；B)是分生孢子聚集的情形；C)是分生孢子单 个的形态。
【具体实施方式】
[0022] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行详细说明。
[0023] 本发明提供一种提高真菌产巴卡亭III产率的氧化环境发酵方法，包括以下步 骤：在液体培养基中培养产巴卡廷III的红豆杉内生菌，当真菌在培养基中培养一段时间 后，第一次加入双氧水，然后每隔3天分别加入双氧水，直至发酵结束，通过加过氧化氢所 产生的培养环境，提高所培养内生真菌的巴卡廷III产生量。
[0024] 其中，培养基为PDB培养基，其组成为gL:马铃薯600-2400,蔗糖260， ρΗ5· 0-7.0。红豆杉内生菌是产巴卡廷III的红豆杉内生菌Diaporthe phaseolorum的菌 株 no. 79 (已公开发表，参考文献 Jian et al. (2013) Isolation ofan endophytic fungus producing baccatin III from Taxus wallichianavar. mairei. J. Ind.Microbiol. Biotechnol. 40:1297 - 1302)，红豆杉内生菌 Diaporthe phaseolorum 的菌株 no. 79 的菌落 形态和分生孢子形态如图I所示。
[0025] 培养一段时间的具体时间长度是2天（48小时）。第一次加入双氧水的量为30ml/ L。以后每隔三天加入双氧水的量是60ml/L。
[0026] 回收并提纯巴卡廷III的步骤包括：
[0027] 1)真菌培养液用滤纸过滤备用，菌丝体残渣加入石英砂被充分研磨，研磨的后的 残渣在45°C条件下被充分干燥，然后称重备用。
[0028] 2)将干燥称重后的菌丝体粉末放入30ml的氯仿/甲醇（1: 1，v/v)混合液，充分混 匀为悬浊液，然后在超声波震荡30分钟，过滤，将滤渣再一次用同样方法再一次提取。
[0029] 3)合并两次所得滤液并在40°C条件下低压旋转蒸发，然后将所的到的膏状蒸发 残留物溶解在30ml氯仿中，然后用30ml的水再次抽提；
[0030] 4)有机相被收集，并在旋转蒸发器中40°C旋转蒸发，所得干燥残留物被溶解在 5ml的甲醇中，并用0. 451m孔过滤器过滤备用；
[0031] 5)过滤后的真菌培养液在70°C条件下低真空旋转蒸发；
[0032] 6)当液体剩余IOml左右时，加入30ml氯仿/甲醇（I: 1，v/v)混合液，然后使用和 菌丝体相同的方法进行巴卡廷III的分离；
[0033] 7)将4)和6)中各自所获得的溶有提取物的5ml甲醇溶液混合为10ml，备用。
[0034] 以99. 5%的巴卡廷III作为标准品，用高效液相方法对上述提取自发酵液和菌丝 体的提取物进行巴卡廷III含量的测定。
[0035] 采用本方法培养巴卡廷III与常规培养方法相比，其产率结果如表1所示，其产率 大大提尚。
[0036] 表1添加过氧化氢培养和对照巴卡廷III的产率比较（单位：mg/l)
[0037]
[0038] 本发明通过加入过氧化氢使红豆杉内生菌Diaporthe phaseolorum的菌株no. 79 产巴卡廷III的产率显著增加，方法简便可行，投入低。巴卡廷III属于烷烯类化合物，典 型的次生代谢产物，在高等植物组培和一些微生物培养过程中，当将这些生物细胞植物氧 化环境时会导致这些生物细胞的次生代谢产物产量显著增加，因此该发明正是依据该原理 通过添加过氧化氢使no. 79的巴卡廷III产率显著增加。
[0039] 本发明通过添加过氧化氢不仅投资低，而且环保。原因在于过氧化氢在巴卡廷III 提取和纯化过程及其容易分解而变为水和氧气，不存在对提取产物的污染和对人体可能的 危害。
【主权项】
1. 一种提高真菌产巴卡亭III产率的氧化环境发酵方法，其特征在于，包括以下步 骤：在液体培养基中培养产巴卡廷III的红豆杉内生菌，Diaporthe phaseolorum的菌株 no. 79,当真菌在培养基中培养一段时间后，第一次加入双氧水，然后每隔3天添加一次双 氧水，直至发酵结束，得到真菌培养液，并对真菌培养液进行回收和提纯。2. 根据权利要求1所述的提高真菌产巴卡亭III产率的氧化环境发酵方法，其特征在 于，所述培养基为PDB培养基，其组成为：水1000ml、马铃薯600g、蔗糖280g、pH 6. 5-7. 0。3. 根据权利要求1所述的提高真菌产巴卡亭III产率的氧化环境发酵方法，其特征在 于，所述培养一段时间的具体时间长度是2天。4. 根据权利要求1所述的提高真菌产巴卡亭III产率的氧化环境发酵方法，其特征在 于，所述第一次加入双氧水的量为每1000 ml培养基中加入30ml双氧水。5. 根据权利要求1所述的提高真菌产巴卡亭III产率的氧化环境发酵方法，其特征在 于，所述每隔三天加入双氧水的量为每1000 ml培养基中加入60ml双氧水。6. 根据权利要求1所述的提高真菌产巴卡亭III产率的氧化环境发酵方法，其特征在 于，所述的回收并提纯巴卡廷III的步骤包括： 1) 真菌培养液用滤纸过滤备用，菌丝体残渣加入石英砂被充分研磨，研磨的后的残渣 在45°C条件下被充分干燥，然后称重备用； 2) 将干燥称重后的菌丝体粉末放入30ml体积比为1:1的氯仿/甲醇混合液，充分混匀 为悬浊液，然后在超声波震荡30分钟，过滤，将滤渣采用上述方法提取； 3) 合并两次所得滤液并在40°C条件下低压旋转蒸发，然后将所的到的膏状蒸发残留 物溶解在30ml氯仿中，然后用30ml的水再次抽提； 4) 收集有机相，并在旋转蒸发器中40°C旋转蒸发，所得干燥残留物被溶解在5ml的甲 醇中，并用〇.451m孔过滤器过滤备用； 5) 过滤后的真菌培养液在70°C条件下低真空旋转蒸发； 6) 当液体剩余IOml左右时，加入30ml体积比为1:1的氯仿/甲醇混合液，然后使用和 菌丝体相同的方法进行巴卡廷III的分离。
【专利摘要】本发明公开了一种提高真菌产巴卡亭III产率的氧化环境发酵方法，其包括在液体培养基中发酵培养产巴卡廷III的红豆杉内生菌Diaporthe phaseolorum的菌株no.79，当真菌在培养基中培养2天(48小时)后，第一次加入30ml的双氧水，然后每隔3天分别加入60ml的双氧水，直至第21天发酵结束，通过该氧化培养环境，以使在所述菌株处于氧化胁迫环境中，同时为真菌生长提供叫足够的氧气，最终提高所培养内生真菌的巴卡廷III产生量。本发明相比较传统发酵培养方法，显著的提高了菌株no.79的产率，方法简单且经济，适宜于工业化生产，巴卡廷III产率可提高1.8倍。
【IPC分类】C12P17/02
【公开号】CN104975053
【申请号】CN201510359278
【发明人】周修任, 李勇超, 杨靖, 代磊, 简在友, 王鸿升, 许桂芳, 孟丽
【申请人】河南科技学院
【公开日】2015年10月14日
【申请日】2015年6月25日