一种高荧光量子产率的聚合物碳点、制备方法及其在靶向肿瘤细胞检测方面的应用与流程

本发明属于聚合物碳点技术领域，具体涉及一种高荧光量子产率聚合物碳点、制备方法及其在靶向肿瘤细胞检测方面的应用。

背景技术：

聚合物碳点是由碳点发展出来的一类新型材料，是由线性聚合物或单体经过交联或者聚合得到，或是由碳核和表面连接的聚合物链组成，可以分为：共轭聚合物碳点(cpds)和非共轭聚合物碳点(ncpds)两类。我们由共轭分子可以聚合制备得到cpds，如通过水热、聚合、交联、自组装以及其他方法制备而成。

目前，基于荧光材料的纳米传感器得到人们广泛关注，因为他们的响应速度快速，空间分辨率高，常用的荧光材料有半导体量子点、金属纳米簇、有机染料等。荧光聚合物作为荧光材料已经显示出巨大的潜力。聚合物碳点(cpds)作为碳材料家族的新成员，由于具有较高的光吸收量，较好的化学稳定性，生物相容性好以及低的生物毒性，这些优点使它们应用在许多领域有重要应用，例如生物成像、生物传感、催化和光伏器件等。

目前所制备的聚合物碳点荧光量子产率不高，我们设计通过分子内的能量共振转移提高聚合物碳点的荧光量子产率的方法，选用生物靶向分子叶酸为原料，制备荧光量子产率比较高的聚合物碳点。同时由于叶酸受体是一些癌细胞(如宫颈、乳腺、肺、前列腺、喉癌等癌细胞)的靶向感受器，使用含有叶酸修饰的聚合物碳点可以实现对肿瘤细胞的靶向检测和选择性成像的功能。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种高荧光量子产率的聚合物碳点、制备方法及其在靶向肿瘤检测方面的应用。

在本发明中，以生物靶向分子叶酸为原料，采用简单水热方法一步合成具有较高荧光量子产率的聚合物碳点，其对肿瘤细胞具有靶向检测和选择性成像功能。其具有合成方法简单、粒子粒径小、尺寸均匀、量子产率高、生物毒性低、生物相容性好等优点。该荧光聚合物碳点的量子产率高，可用于生物成像，并且对肿瘤细胞具有靶向功能，可作为癌症诊断和治疗的荧光显像材料来使用，在肿瘤检测、药物缓释等领域发挥重要作用。

本发明所述的对肿瘤细胞靶向检测和生物成像功能的荧光聚合物碳点的制备方法，其步骤如下：

(1)在盛有8～15ml去离子水的反应器中，加入0.01～0.05mmol氨基酸和0.01～0.05mmol对癌细胞具有靶向作用的材料，在室温下强烈搅拌(200转/分～500转/分)，使二者充分溶解，形成黄色水溶液；当原料用量不同时，所得产物的荧光量子产率不同。

(2)将步骤(1)得到的黄色水溶液微热法处理8～30min后，或者水热法处理8～12h，溶液由淡黄色变成深黄色，获得聚合物碳点水溶液；

(3)将步骤(2)得到的聚合物碳点水溶液，用0.22μm～0.45μm水相滤头过滤，除去尺寸较大杂质；

(4)随后将步骤(3)得到的滤液用800～1000分子量的渗析袋渗析处理48～72h，每隔2～6h换一次去离子水，将渗析处理后的产品旋蒸除去大量的去离子水，得到3～5ml本发明所述的高荧光量子产率的聚合物碳点水溶液，放入4℃冰箱保藏。

将步骤(4)得到的聚合物碳点水溶液稀释至浓度为80～120ug/ml，共做两组实验，第一组是将聚合物碳点水溶液与正常的t-293细胞(肾上皮细胞)在37℃下共培养4h；第二组是将聚合物碳点水溶液与癌细胞的hela细胞(宫颈癌细胞)在37℃共培养4h。

上述方法中，氨基酸是精氨酸、组氨酸、赖氨酸或酪氨酸；

上述方法中，对癌细胞具有靶向作用的材料是叶酸；

上述方法中，步骤(2)中加热处理方式为微波直接加热法(置于微波化学反应器)和水热方法(置于水热反应釜中，150～200℃加热处理)。

本发明具有如下优点：1、合成聚合物碳点的原料来源丰富、价廉易得，碳点制备过程方法简单，绿色环保，可大量合成生产；2、该聚合物碳点的粒径小，尺寸均一，可以稳定分散在水中，无团聚现象；3、合成的聚合物碳点具有优良的荧光性质，因为存在荧光共振能量转移性质，其荧光量子产率高；4、聚合物碳点的荧光性质具有优异的稳定性，在不同的ph值(ph＝4～10)下荧光性能稳定，这是其应用于生物检测、化学传感、光电器件等领域的基础；5、聚合物碳点生物毒性低，可以实现活细胞成像，与细胞共培养4h后，聚合物碳点很少能进入正常细胞，但能大量进入癌细胞，能对肿瘤细胞具有靶向检测和生物成像功能，可以作为癌症的诊断和治疗的荧光显像材料来使用。

附图说明

图1：为合成的聚合物碳点的透射电镜照片，其粒径约为6nm(实施例1)；

图2：为聚合物碳点的ft-ir光谱。它们所包含的-oh、c＝o、cn(c＝n)、-nh和-ch基团，表明该碳量子点结构中含有叶酸分子(实施例1)；

图3：为聚合物碳点水溶液的(i)紫外—可见吸收光谱和(ii)荧光发射光谱。插图显示的聚合物碳点水溶液在(iii)可见光和(iv)紫外光下的光学照片，表明聚合物碳点在水中分散均匀，且具有优良的蓝色荧光性质(实施例1)；

图4：为聚合物碳点的原料中，氨基酸的荧光发射光谱(i)与叶酸的荧光激发光谱(ii)。二者很好地重叠在一起，表明它们之间存在荧光共振能量转移性质，使得聚合物碳点荧光量子产率高达59％(实施例1)。

图5：为聚合物碳点水溶液的在ph＝2～12的荧光强度谱图。在ph＝4～10的条件下，聚合物碳点水溶液的荧光性能稳定(实施例1)。

图6：为激光共聚焦荧光显微镜照片。将聚合物碳点分别与t-293正常细胞(iandii)和hela癌细胞(iiiandiv)共同培养4h的共聚焦图像；(iandiii)明场，(iiandiv)共聚焦荧光图像，图中圆圈标识为聚合物碳点进入细胞并显示荧光成像位置。结果显示聚合物碳点4h很少进入正常细胞；相同的时间，聚合物碳点大量进入癌细胞。表明聚合物碳点具有靶向识别肿瘤细胞和荧光成像的功能(实施例1)。

具体实施方式

实施例1：

(1)在盛有10ml去离子水的反应器中，加入0.01mmol赖氨酸和对癌细胞具有靶向作用的材料叶酸0.01mmol，在室温下强烈搅拌(400转/分)，使二者充分溶解，形成黄色水溶液；

(2)将步骤(1)得到的黄色溶液放入微波化学反应器10min后，溶液由淡黄色变成深黄色，获得聚合物碳点；

(3)将步骤(2)得到的液体，用0.22μm水相滤头过滤，除去尺寸较大杂质。

(4)随后将步骤(3)溶液用800～1000分子量的渗析袋渗析处理48h，每隔4h换一次去离子水，将渗析处理后的产品旋蒸除去大量的水，剩余聚合物碳点水溶液3ml，测量产品荧光量子产率56％，将产品放入4℃冰箱冷藏待用；

(5)将步骤(4)得到的聚合物碳点稀释至浓度为100ug/ml，共做两组实验，第一组是将聚合物碳点与正常的t-293测量产品荧光量子产率56％，将产品放入4℃冰箱冷藏待用；细胞(肾上皮细胞)在37℃下共培养4h；第二组是将聚合物碳点与癌细胞的hela细胞(宫颈癌细胞)在37℃下共培养4h。

实施例2：

(1)在盛有10ml去离子水的反应器中，加入0.02mmol赖氨酸和对癌细胞具有靶向作用的材料叶酸0.01mmol，在室温下强烈搅拌(400转/分)，使二者充分溶解，形成黄色水溶液；

(2)将步骤(1)得到的黄色溶液转移到50ml聚四氟乙烯水热反应釜内衬中并装好钢套,在烘箱中逐渐加热到180℃并恒温10h，自然冷却至室温，获得聚合物碳点水溶液；

(3)将步骤(2)得到的液体，用0.22μm水相滤头过滤，除去尺寸较大杂质。

(4)随后将步骤(3)溶液用800～1000分子量的渗析袋渗析处理48h，每隔4h换一次去离子水，将渗析处理后的产品旋蒸除去大量的水，剩余聚合物碳点水溶液3ml，测量产品荧光量子产率46％，将产品放入4℃冰箱冷藏待用；

(5)将步骤(4)得到的聚合物碳点稀释至浓度为100ug/ml，共做两组实验，第一组是将聚合物碳点与正常的t-293细胞(肾上皮细胞)在37℃共培养4h；第二组是将聚合物碳点与癌细胞的hela细胞(宫颈癌细胞)在37℃共培养4h。在相同的培养时间后，聚合物碳点大量进入癌细胞，而只有少量进入正常细胞。表明聚合物碳点具有靶向识别肿瘤细胞和荧光成像的功能。

实施例3：

(1)在盛有12ml去离子水的反应器中，加入0.01mmol酪氨酸和对癌细胞具有靶向作用的材料叶酸0.01mmol，在室温下混合均匀，并超声10min，使二者充分溶解，此时形成黄色水溶液。

(2)将步骤(1)得到的黄色溶液转移到50ml聚四氟乙烯水热反应釜内衬中并装好钢套，在烘箱中逐渐加热到180℃并恒温10h，自然冷却至室温，获得聚合物碳点。

(3)将步骤(2)得到的液体，用0.22μm水相滤头过滤，除去尺寸较大杂质。

(4)随后将步骤(3)溶液用800～1000分子量的渗析袋渗析处理48h，每隔4h换一次去离子水，将渗析处理后的产品旋蒸除去大量的水，剩余聚合物碳点溶液3ml，测量产品荧光量子产率38％，将产品放入4℃冰箱冷藏待用；

(5)将步骤(4)得到的聚合物碳点稀释至浓度为100ug/ml，共做两组实验，第一组是将聚合物碳点与正常的t-293细胞(肾上皮细胞)共培养4h；第二组是将聚合物碳点与癌细胞的hela细胞(宫颈癌细胞)共培养4h。在相同的培养时间后，聚合物碳点大量进入癌细胞，而只有少量进入正常细胞。表明聚合物碳点具有靶向识别肿瘤细胞和荧光成像的功能。