[0038]评价指标主要由颗粒细胞的存活率决定，打印温度控制在37°C。打印成型后，将人造颗粒细胞半球加入含大于10 %人卵泡液的培养液中培养24小时。含大于10 %人卵泡液的培养液为:TCM199培养基，0.075IU/ml FSH(卵泡刺激素)，0.15IU/ml hCG(人绒毛膜促性腺激素)，0.2 μ g/ml的17 β -雌二醇，体积含量10 % FCS (胎牛血清)，体积含量彡10%处理后的人成熟卵泡液。
[0039]采用Live/Dead法对三维细胞进行染色，定性观察细胞存活情况；采用AlamarBlue法做定量细胞增殖研究。采用多聚甲醛固定海藻酸钠中的颗粒细胞，并采用扫描电子显微镜(SEM)观察海藻酸钠水凝胶中颗粒细胞的形态。采用免疫组化的手段对颗粒细胞特异性蛋白标志物进行染色。
[0040]将培养了 24小时的人造颗粒细胞半球，加入分离得到的卵丘颗粒细胞-卵母细胞复合体(OCC)。如图2所示，共培养24小时后，观察卵母细胞的成熟情况(有无明显得减数分裂)，以评估该IVM模型的可行性。
[0041]结果显示，经过人造颗粒细胞半球三维培养后的未成熟卵母细胞的成熟率显著提尚O
[0042]实施例2采用胶原蛋白水凝胶来构建人造颗粒细胞半球促进未成熟卵母细胞成熟
[0043]将采集到的颗粒细胞放入细胞培养瓶中培养，培养基为TCM199培养基，加入10 %胎牛血清以及0.1 %青霉素-链霉素混合物，放置37°C含5 % CO2培养箱中培养2-7日，取对数生长期的细胞采用0.25 %的胰蛋白酶消化，细胞经过重悬与胶原蛋白溶液混合均匀，静置成水凝胶胶，最终每mL水凝胶内颗粒细胞浓度为17颗。
[0044]将颗粒细胞-胶原蛋白混合凝胶作为墨水进行三维打印，采用计算机辅助设计技术精确设计打印的图形，针对卵泡的形状，设计成碗状结构。此半球状结构的壁由颗粒细胞与胶原蛋白水凝胶混合而成，直径10mm，球壁厚度100 μπι，以此来模拟卵泡中的壁颗粒细胞。
[0045]评价指标主要由颗粒细胞的存活率决定，打印温度控制在37°C。打印成型后，将人造颗粒细胞半球加入含大于10 %的人卵泡液的培养液中培养48小时。含大于10 %人卵泡液的培养液为:TCM199培养基，0.075IU/ml FSH(卵泡刺激素)，0.15IU/ml hCG(人绒毛膜促性腺激素)，0.2 μ g/ml的17 β -雌二醇，体积含量10 % FCS (胎牛血清)，体积含量彡10 %处理后的人成熟卵泡液。
[0046]采用Live/Dead法对三维细胞进行染色，定性观察细胞存活情况；采用AlamarBlue法做定量细胞增殖研究。采用多聚甲醛固定胶原蛋白中的颗粒细胞，并采用扫描电子显微镜(SEM)观察胶原蛋白水凝胶中颗粒细胞的形态。采用免疫组化的手段对颗粒细胞特异性蛋白标志物进行染色。
[0047]将在含人卵泡液的培养液中培养了 48小时的人造颗粒细胞半球，加入分离得到的卵丘颗粒细胞-卵母细胞复合体(OCC)。共培养48小时后，观察卵母细胞的成熟情况(有无明显得减数分裂)，以评估该IVM模型的可行性。
[0048]结果显示，经过人造颗粒细胞半球三维培养后的未成熟卵母细胞的成熟率显著提尚O
[0049]实施例3采用明胶水凝胶来构建人造颗粒细胞半球促进未成熟卵母细胞成熟
[0050]将采集到的颗粒细胞放入细胞培养瓶中培养，培养基为TCM199培养基，加入10%胎牛血清以及0.1 %青霉素-链霉素混合物，放置37°C含5 % C02培养箱中培养3-7日，取对数生长期的细胞采用0.25 %的胰蛋白酶消化，细胞经过重悬与明胶溶液(先溶于65-70°C热水再静置降温到37°C左右)混合均匀，35°C静置成水凝胶，最终每mL水凝胶内颗粒细胞浓度为16颗。
[0051]将颗粒细胞-明胶混合凝胶作为墨水进行三维打印，采用计算机辅助设计技术精确设计打印的图形，针对卵泡的形状，设计成碗状结构。此半球状结构的壁由颗粒细胞与明胶水凝胶混合而成，直径10_，球壁厚度100 μ??，以此来模拟卵泡中的壁颗粒细胞。
[0052]评价指标主要由颗粒细胞的存活率决定，打印温度控制在37°C。打印成型后，将人造颗粒细胞半球加入含大于10 %的人卵泡液的培养液中培养36小时。含大于10 %人卵泡液的培养液为:TCM199培养基，0.075IU/ml FSH(卵泡刺激素)，0.15IU/ml hCG(人绒毛膜促性腺激素)，0.2 μ g/ml的17 β -雌二醇，体积含量10 % FCS (胎牛血清)，体积含量彡10 %处理后的人成熟卵泡液。
[0053]采用Live/Dead法对三维细胞进行染色，定性观察细胞存活情况；采用AlamarBlue法做定量细胞增殖研究。采用多聚甲醛固定明胶水凝胶中的颗粒细胞，并采用扫描电子显微镜(SEM)观察明胶水凝胶中颗粒细胞的形态。采用免疫组化的手段对颗粒细胞特异性蛋白标志物进行染色。
[0054]将在含人卵泡液的培养液中培养了 36小时的人造颗粒细胞半球，加入分离得到的卵丘颗粒细胞-卵母细胞复合体(OCC)。共培养36小时后，观察卵母细胞的成熟情况(有无明显得减数分裂)，以评估该IVM模型的可行性。
[0055]结果显示，经过人造颗粒细胞半球三维培养后的未成熟卵母细胞的成熟率显著提尚O
[0056]实施例4、5、6分别将实施例1中的海藻酸钠替换成壳聚糖、透明质酸、层粘联蛋白，并采用各自的凝胶化手段制成凝胶；其他实验条件与实施例1相同，最后得到成熟卵母细胞。
[0057]上述％指代的均是体积百分含量；颗粒细胞是指卵泡中卵母细胞四周围绕着的菱形或扁平的细胞浆中含有颗粒的细胞；人成熟卵泡液的处理过程是首先将卵泡液离心，56°C灭活，0.22 μ m过滤，-20°C低温保存备用；未成熟卵母细胞-颗粒细胞复合体(OCC)具体是从人卵巢中取出的未成熟卵母细胞以及其上包围的颗粒细胞的复合物。
[0058]上述实施例并非是对于本发明的限制，本发明并非仅限于上述实施例，只要符合本发明要求，均属于本发明的保护范围。
【主权项】
1.一种利用3D打印技术促进人未成熟卵母细胞体外成熟的方法，其特征在于该方法包括以下步骤: 步骤(I)、颗粒细胞的预处理: 将临床采集分离得到的颗粒细胞首先采用体外培养的方法进行增殖，放入37°C、含体积含量5 % CO2的细胞培养箱培养2?7天，每2天更换培养基一次；取对数生长期的细胞，采用胰蛋白酶消化后制成细胞悬液； 所述的体外培养采用的培养基为在TCM199培养基中加入体积含量10 %胎牛血清、体积含量0.1 %青霉素-链霉素混合物； 步骤(2)、将生物水凝胶与预处理后的颗粒细胞混合均匀，作为3D打印用墨水；其中每mL生物水凝胶加入15?10 7数量的颗粒细胞； 步骤(3)、由于生物水凝胶的选择不同，采用不同成熟凝胶化手段，将3D打印用墨水制成3D打印用凝胶； 步骤(4)、采用生物3D打印的方法将步骤(3)得到的3D打印用凝胶打印成具有生产工艺需求形状的产品，即人造卵泡； 步骤(5)、在步骤(4)打印完成的产品中加入含体积百分含量多10 %人成熟卵泡液的培养液中，培养24?48h后得到人造颗粒细胞半球； 其中所述的培养液为:TCM199 培养基，0.075IU/ml FSH, 0.15IU/ml hCG，0.2 μ g/ml 的17 β-雌二醇，体积含量10 % FCS，体积含量彡10 %处理后的人成熟卵泡液； 步骤(6)、在步骤(5)得到的人造颗粒细胞半球中加入未成熟卵母细胞-卵丘颗粒细胞复合体，然后采用3D细胞培养的方式培养24?48小时来帮助其成熟，最后得到成熟卵母细胞。2.如权利要求1所述的一种利用3D打印技术促进人未成熟卵母细胞体外成熟的方法，其特征在于所述的胰蛋白酶与对数生长期的细胞的体积比为1:3。3.如权利要求1所述的一种利用3D打印技术促进人未成熟卵母细胞体外成熟的方法，其特征在于所述的青霉素-链霉素混合物含有青霉素100U/ml，链霉素0.lmg/ml。4.如权利要求1所述的一种利用3D打印技术促进人未成熟卵母细胞体外成熟的方法，其特征在于所述的颗粒细胞是指卵泡中卵母细胞四周围绕着的菱形或扁平的细胞浆中含有颗粒的细胞。5.如权利要求1所述的一种利用3D打印技术促进人未成熟卵母细胞体外成熟的方法，其特征在于所述的生物水凝胶可以但不局限为:海藻酸钠、胶原蛋白、明胶、壳聚糖、透明质酸、层粘联蛋白中的一种。6.如权利要求1所述的一种利用3D打印技术促进人未成熟卵母细胞体外成熟的方法，其特征在于步骤(4)所述的生物3D打印采用0.5mm 口径的喷嘴。7.如权利要求1所述的一种利用3D打印技术促进人未成熟卵母细胞体外成熟的方法，其特征在于步骤(5)所述的人成熟卵泡液的处理过程是首先将卵泡液离心，56°C灭活，0.22 μ m过滤，-20 °C低温保存备用。8.如权利要求1所述的一种利用3D打印技术促进人未成熟卵母细胞体外成熟的方法，其特征在于步骤(6)所述的未成熟卵母细胞-颗粒细胞复合体具体是从人卵巢中取出的未成熟卵母细胞以及其上包围的颗粒细胞的复合物。
【专利摘要】本发明公开一种利用3D打印技术促进人未成熟卵母细胞体外成熟的方法。该方法是将临床采集分离得到的颗粒细胞首先采用体外培养的方法进行增殖，培养2～7天；将生物水凝胶与预处理后的颗粒细胞混合均匀，采用生物3D打印出人造卵泡；在人造卵泡中加入含体积百分含量≥10﹪人成熟卵泡液的培养液，培养24～48h后加入未成熟卵母细胞-卵丘颗粒细胞复合体，3D细胞培养24～48小时帮助其成熟。本发明采用3D含细胞打印技术，采用人体颗粒细胞来构建未成熟卵母细胞3D培育系统，同时加入多种生长因子和模拟卵泡培养液，创造出一个真实模拟人体内卵泡的环境来促使未成熟卵母细胞的体外成熟。
【IPC分类】C12N5/075
【公开号】CN105039245
【申请号】CN201510378273
【发明人】金帆, 张帆, 马梁, 全胜, 蔡立义, 王丽雅, 王大辉, 姜中石, 张诚程, 张无忧, 王祺婧
【申请人】浙江大学, 杭州安体科技有限公司
【公开日】2015年11月11日
【申请日】2015年7月1日