一种人工改造功能蛋白的方法
【专利说明】一种人工改造功能蛋白的方法
【背景技术】：
[0001] 功能蛋白的人工改造进化是改变蛋白质的结构和性质满足工业化需求的有效途 径，现在定向进化技术已被用于上百个酶的进化，大大提高了生物酶的活性和效率，在工 业、农业、生物制药等方面产生了巨大影响。
[0002] 功能蛋白的定向进化的成功与否主要取决于所构建的突变文库是否具有足够高 的多样性及库容量。根据文库构建原理的不同，可分为理性进化和随机进化两种策略。理 性进化策略需要事先分析蛋白质的结构，预测和构建三维结构。理性进化只适用于结构与 功能之间的关系已经比较清楚的蛋白质，对于分子结构不明确的蛋白很难改造。因而，随机 进化成为十分有效的蛋白质定向进化手段。以易错PCR为代表的随机突变技术和以DNA改 组技术为代表的基因重组技术是目前常用的两种随机进化技术。易错PCR技术在实际应用 中存在一定的局限性，它是通过改变PCR反应体系中的Mg 2+和dNTPs的浓度，改变DNA聚合 酶的保真性，以相继或组合式累计变异来获得理想突变体的方法。由于该技术引入的是点 突变，这就导致获得理想突变体的速度较慢，且目的基因长度太短（小于800bp)。相对于易 错PCR产生的点突变，基于基因序列之间的重组是一种更有效的建立突变体文库方法。目 前，DNA重组的方法很多，如DNA改组、交错延伸重组、随机引物体外重组等。这些方法通过 将亲本基因片段进行混合并连接得到理想突变体。DNA改组技术不仅能将亲本间的突变随 机组合，更易获得突变体，还可以将亲本之间的优势集与一体。但是同源基因重组不能用于 同源性低于70% -80%的基因序列，因此所获得的有效突变体少。
[0003] 1998年，Ostermeier等人建立了渐进式切割产生杂合酶技术（ITCHY)，开创了 非同源性重组的先河，目前已发展了多项非同源重组技术，如不依赖序列同源性的蛋白质 重组方法（SHIPREC)以及非同源随机重组（NRR)等。但是这些方法将DNA的结构域及重 要的功能片段破坏，降低了所构建文库的有效性。为增加有功能个体的比例，研究者开发 出利用蛋白质结构功能片段进行重组构建基因文库的方法，如Block Shuffling，Domain Shuffling和Module Shuffling等。但是这些方法重组模块序列长且数量少，形成的重组 基因文库多样性低。2008年，Graziano等利用蛋白质的二级结构单元为重组模块，成功获 得可溶性蛋白。Graziano等首先从PDB蛋白质数据库中查找并选取大肠杆菌中所有蛋白质 的二级结构，选取了 4种蛋白质的二级结构类型（a-helix，0-strand，loop-H，loop-S)， 同时依据不同的二级结构设计16种不同Linker，首先利用PCR的方法形成DNA双链基因 库，加入限制性核酸内切酶消化双链DNA形成粘性末端，利用连接酶将DNA片段连接成长 链，加入上下游引物PCR扩增后，连接入载体导入受体菌中，进行表达及筛选。该方法需设 计多条Linker，设计的Linker长度达到54bp，同一二级结构需要设计连接不同的Linker， 增加了实验成本；连接为半随机连接，降低了文库的库容量。
【发明内容】
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[0004] 本发明的目的是克服现有技术存在的缺陷和不足，为人们提供一种功能蛋白定向 进化的方法。
[0005] 本发明所述一种人工改造功能蛋白的方法，以目标蛋白分子结构为基础，选取文 库构建重组模块，所述模块为二级结构单元（a -螺旋，0 -折叠片，0 -转角），并包括重要 的催化活性位点及配体结合位点区域，通过将所述模块区域基因引入Linker，并使用限制 性核酸内切酶进行酶切，酶切片段完全随机连接组合构建重组基因文库，表达并筛选。
[0006] -种人工改造功能蛋白的方法，具体的步骤为：
[0007] (1)根据目标酶蛋白结构，在蛋白数据库中查询获得所述蛋白质序列，选取文库构 建重组模块，所述模块为其二级结构单元（ a -螺旋，0 -折叠片，0 -转角），并包括重要的 催化活性位点及配体结合位点区域；
[0008] (2)确定所述各模块区域的基因片段；
[0009] (3)利用PCR或者人工合成的方式在所选取的基因片段两端加入Linker，形成两 端Linker的单链DNA ;
[0010] (4)将所述目标酶蛋白序列首尾基因片段作为终止序列，并只在所述终止序列一 端加入Linker，形成一端Linker的单链DNA ;
[0011] (5)在聚合酶的作用下，将步骤3和步骤4所得单链DNA合成为双链DNA，使用限 制性核酸内切酶酶切所述双链DNA，产生粘性末端，形成酶切片段；
[0012] (6)在连接酶作用下，将步骤5所得酶切片段连接，形成重组基因文库；
[0013] (7)所述基因文库的扩增及表达，将连接后的重组基因文库进行PCR扩增，扩增引 物引入酶切位点，回收不小于原始基因长度区域的DNA片段，酶切后与载体连接，表达并筛 选。
[0014] 当步骤（6)连接后的主要片段产物长度小于所述目标蛋白基因序列长度，通过重 聚PCR进行延长；
[0015] 所述Linker经酶切后连接两个模块的基因序列的碱基数为3的倍数，翻译后的氨 基酸为柔性氨基酸。
[0016] 进一步的，所述Linker经酶切后连接两个模块的基因序列的长度为9个碱基，减 少Linker在重组后序列中的比例，降低了 Linker对文库功能的影响。
[0017] 所述方法Linker经酶切后形成同一互补的粘性末端，因此保证了在重组基因文 库的时候是模块间的完全随机的结合。
[0018] 本方法利用蛋白质的二级结构及重要的功能结构区域为组合基本模块，以一个含 有20个模块为例，随机组合能产生20 2°种不同的序列组合方式，具有庞大的序列组合空间， 提高了所构建文库的多样性，同时以蛋白质的二级结构及重要的功能结构区域为模块，利 用了原有的功能结构，提高了组合文库的有效性，促进了功能蛋白的定向进化改造。
[0019] 所述目标功能蛋白为1个或多个蛋白质，可对某一蛋白质功能定向改造，也可利 用多种蛋白质的二级结构创造出新的蛋白质。
[0020] 所述模块以单个二级结构单元为主，其含有的氨基酸个数为3-50个，优选氨基酸 个数为3-20的模块，模块氨基酸个数少，目标蛋白质含有模块数多，所构建重组文库多样 性高。
[0021] 所述模块经连接重组后形成的基因文库所包含的模块数不小于6个，保证了文库 的多样性。
[0022] 所述粘性末端为非回文序列，保证在连接重组时双链DNA不会反向连接，形成有 义重组。
[0023] 所述方法建立在已知蛋白序列及功能的基础上，能更加高效的筛选出功能更强大 的功能蛋白。
[0024] 有益效果：
[0025] 本发明所述的一种人工改造功能蛋白的方法，利用蛋白质的二级结构及重要的功 能结构区域为组合基本模块，通过模块间的完全无序的随机组合，构建蛋白质文库，通过筛 选，定向获得更好效率的功能蛋白。所述方法构建的文库数据庞大，功能定向可控，通过对 新的功能蛋白质结构的分析，了解新的功能蛋白质中有效的模块重组及有效模块，为了解 目标蛋白质的结构功能生物学信息并辅助完善理性设计蛋白质提供帮助。
【附图说明】：
[0026] 图1P00552二级结构图
[0027] 图2 P00552结构域示意图
[0028] 图3首尾序列浓度优化，其中M. DL 2000 DNA Marker ; 1-3.不同的首尾序列浓度， 首尾序列浓度依次为50 %、10 %、2 %
[0029] 图4重聚PCR循环数优化，其中M. DL 2000 DNA Marker ;1-3.不同循环数的重聚 产物，循环数依次为3、5、10
[0030] 图5重聚PCR模板浓度优化，其中M. DL 2000 DNA Marker ; 1-4.不同的模板浓度 重聚产物，模板浓度依次为250ng/ y L、50ng/ y L、10ng/ y L、2ng/ y L
[0031] 图6菌落PCR电泳图
[0032] 图7测序结果模拟图
【具体实施方式】：
[0033] -种人工改造卡那霉素抗性蛋白的方法：
[0034] 1.根据目标酶蛋白结构，在蛋白数据库中查询获得所述蛋白质序列，选取模块，所 述模块为其二级结构单元螺旋，折叠片，转角），包括重要的催化活性位点及 配体结合位点区域；
[0035] 从EBI (欧洲生物信息研究所）中查询卡那霉素抗性蛋白，查找结构信息明确的蛋 白质。其蛋白质编号为P00552、P00553、P05057。
[0036] 将查找到的蛋白质在(蛋白质晶体结构资料数据库）中分析其相应的结构功 能生物学信息。找出相应模块，包括所述蛋白质的基本二级结构（a-螺旋，折叠片， 0 _转角等），以及重要的催化活性位点及配体结合位点。
[0037] P00552氨基酸序列为：
[0038] MIEQDGLHAGSPAAWVERLFGYDWAQQTIGCSDAAVFRLSAQGRPVLFVKTDLSGALNELQDEAARLSff LATTGVPCAAVLDVVTEAGRDWLLLGEVPGQDLLS