man探针：5, -TCTGCAACTGTTTCTC-MGB-3' ；
[0033] ⑤针对UBE2C基因设计的特异性引物和Taqman探针：
[0034] 上游引物：5,-ACCTACCCCCGCACATCAT-3' ；
[0035] 下游引物：5'-GTGGGTCTGCGGTCAGTGT-3' ；
[0036] Taqman探针：5, -CTGGTGTACAAGGAGGTG-MGB-3'。
[0037] 其二：基于SYBRGreen荧光染料法的荧光定量PCR试剂盒，包括荧光染料以及针 对所述生物标记物设计的特异性引物，所述特异性引物为以下⑥~⑩中的至少一对：
[0038] ⑥用于扩增HECTD3基因的特异性引物为：
[0039] 上游引物：5,-CTCATAGCAGCCACCTTCATTC-3' ；
[0040] 下游引物：5'-ACCGCTTCTTTGGGACACTTG-3' ；
[0041] ⑦用于扩增PSMB10基因的特异性引物为：
[0042] 上游引物：5'-CCCATAGCCAATCAGTAGCC-3' ；
[0043] 下游引物：5'-TTAGGTCTCAACTCTTCCGTCAT-3' ；
[0044] ⑧用于扩增UBD基因的特异性引物为：
[0045] 上游引物：5'-CAACAGCGGAACCTCCAGTCTC-3' ；
[0046] 下游引物：5'-CGGTCCTCCTTGAATGCCAC-3' ；
[0047] ⑨用于扩增UBE2C基因的特异性引物为：
[0048] 上游引物：5'-AGCATTCCACTGCCCAAAGG-3' ；
[0049] 下游引物：5' -CGCTCCACCGTAACCACAGATAG-3' ；
[0050] ⑩用于扩增UBE2S基因的特异性引物为：
[0051] 上游引物：5'-TTGGTAGCCGTGGTTATCTCT-3' ；
[0052] 下游引物：5' -ACACTCTCAGCCAGTCCCTTAG-3'。
[0053] 两种荧光定量PCR试剂盒均进一步包含有用于扩增内参基因0 -actin的特异性 引物，所述内参基因0-actin的特异性引物为：
[0054] 上游引物：5'-GCATACACGAAACTACCTTCAACTCC-3' ；
[0055] 下游引物：5' -ATGGTGGTGCCGCCAGACA-3'。
[0056] 此外，还可针对本发明的生物标记物涉及探针，用以制备用于预测乳腺癌新辅助 化疗疗效的生物芯片。
[0057] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0058] 本发明筛选到一组泛素化途径相关基因，其中HECTD3基因和PSMB10基因在pCR 组和NpCR组中存在极显著的表达差异（P〈0. 01)，而UBD、UBE2C和UBE2S基因在pCR组和 NpCR组中存在显著的表达差异（P〈0. 05)，体现为与pCR组相比，在NpCR组中，PSMB10基因、 UBD基因、UBE2C基因和UBE2S基因的表达显著下调，而HECTD3基因的表达则显著上调；提 示这五个泛素化途径相关基因能够作为生物标记物，用来预测乳腺癌新辅助化疗疗效，避 免新辅助化疗盲目性。
【附图说明】
[0059] 图1A为pCR和NpCR组基因表达分布；
[0060] 其中，" log2 (read counts for each gene) in pCR"表不 pCR 组中基因的读长 log2 值；"l〇g2(read counts for each gene) in NpCR" 表示 NpCR 组中基因的读长 log2值；pCR 代表新辅助化疗后，在乳腺和腋窝淋巴结均无浸润性癌组织残留的样本组，NpCR代表新辅 助化疗后，只要原发肿块或/和转移病灶仍有浸润性癌组织残留的样本组，下同；
[0061] 图1B为pCR和NpCR组中分配到人转录本上的唯一性匹配的reads数分布；
[0062] 其中，"log2 (Number of reads mapped to a gene) "表示比对到转录本片段的有 效读长数的l〇g2值；
[0063] 图2为数字基因表达谱测序差异表达基因聚类分析；
[0064] 图3为荧光定量验证pCR组和NpCR组中差异基因的表达；
[0065] 其中，"Relative Quantification" 表不相对表达量。
【具体实施方式】
[0066] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细说明。
[0067] 实施例1差异表达基因的筛选
[0068] 在浙江省肿瘤医院接受治疗的20例未经NACT的乳腺癌患者穿刺癌组织获取乳腺 癌组织样本，入组患者要求有明确的细胞学诊断，手术前未经任何治疗，且有完整的病理信 息。
[0069] 取样完成后对患者进行新辅助化疗，并根据疗效区分pCR组和NpCR组；同时对乳 腺癌组织样本作如下处理：
[0070] 1、乳腺癌组织总RNA提取
[0071] (1)总 RNA 提取
[0072]1)在较少RNase干扰的清洁区（所有用具均用1%。DEPC水擦拭），研钵需200°C灭 菌5个小时并冷却4个小时，称取离体乳腺组织样本约20mg至已倒有液氮预冷的研钵中， 用件棒研磨至粉末状（研磨不彻底则会严重影响的RNA的产量）；
[0073] 2)加入700 y 1 QIAzol裂解液至研钵中，继续研磨至无明显组织块的均匀液体， 然后转移至无RNA酶的1. 5ml eppendorf管中；
[0074] 3)冷冻离心机4°C，12000 X g，离心10min以除去溶液中未裂解完全组织及细胞碎 片；
[0075] 4)小心吸取离心后的上清液，移至另一新的eppendorf管，切勿吸取下层细胞碎 片残渣沉淀；
[0076] 5)加入140 y 1氯仿，上下颠倒，剧烈振荡后静置2min ;
[0077] 6)冷冻离心机4°C离心，12000Xg，15min，并将上层清液转移至一新的无RNA酶 eppendorf 管中；
[0078] 7)加入1. 5倍无水乙醇，涡旋混匀，完成组织裂解；
[0079] 8)将所有液体全部转移至吸附柱中，并将吸附柱置于2ml的收集管内，8000Xg离 心15s，弃收集管中的滤液；
[0080] 9)取700 y 1的RWT溶液至吸附柱中，8000 X g离心15s，弃滤液；
[0081] 10)取500 y 1的buffer RPE至吸附柱中洗涤，8000 Xg离心15s，弃滤液；
[0082] 11)再次用500 y 1的buffer RPE洗涤吸附柱，8000 Xg离心2min，弃滤液及下层 收集套管；
[0083] 12)将吸附柱转移至一个新的2ml收集管中，全速离心lmin ;
[0084] 13)弃下层收集管，把吸附柱移入新的1. 5ml eppendorf管中，加入45 y 1 RNase-free water 洗脱吸附膜，静置 lmin，8000 Xg 离心 lmin;
[0085] 14)再次全速离心lmin，得到总RNA。
[0086] (2)总RNA的定量和质量检测
[0087] 利用Nanodrop 2000检测乳腺组织RNA样本的含量，经0D值定量测定，以便计算 目标基因反转录时所需要的RNA溶液的体积；经定性检测排除已降解的和DNA污染较严重 的RNA样本，以保证后续实验的特异性。具体检测方法如下：
[0088] 1)总RNA定量：在紫外分光光度计上测定260nm和280nm的0D值，并得出A260/ A280,当其数值在1. 8~2. 0之间说明总RNA的纯度较好；当小于2. 0说明有残余的盐离子 和小分子杂志的污染，当大于2. 0则说明可能总RNA的降解：
[0089] 2)总RNA的完整性检测：1 %甲醛变性琼脂糖凝胶电泳分离总RNA中的核糖体 RNA(rRNA)，最大的两条条带28r RNA和18s RNA的亮度大致比为2:1时，说明RNA的完整 性较好，未出现降解现象。
[0090] 2、分离获取mRNA
[0091]使用 Thermo Fisher 公司的 Sera-mag Magnetic Oligo (dT) Beads 分离得到 mRNA: 向