一种新的黑曲霉菌株及其应用
【专利说明】一种新的黑曲霉菌株及其应用发明领域
[0001]本申请大体上涉及生物发酵领域，具体而言，本申请涉及利用黑曲霉作为生产宿主、棕榈仁柏作为营养素来产生异冰片的生物发酵技术。
[0002]发明背景
[0003]掠桐仁柏(又称为PKC (palm kernel cake)或 PKM(palm kernel meal))是将掠桐仁通过机械压榨或溶剂萃取榨油后的副产品，其形状、颜色与菜籽柏相似。近年来，随着马来西亚、印度尼西亚棕榈树的大规模扩种，棕榈仁柏的产量也大大增加，对棕榈仁柏的开发利用成为国内外研究的热点，段东洋(段东洋，《复合菌种固态发酵棕榈仁柏为菌体蛋白饲料的研究》，华南理工大学硕士论文，2005)描述了棕榈仁柏的生物利用法包括酶降解法和微生物发酵法。
[0004]黑曲霉(Aspergillus niger)是曲霉属(Aspergillus)真菌中的一个常见种，其广泛分布于粮食、植物产品和土壤中。黑曲霉的生长适温为37°C，最低相对湿度为88%，能导致水分较高的粮食霉变。黑曲霉是重要的发酵工业菌种，F.B.1luyemi《Fungal solidstate culture of palm kernel cake)) (B1resource technology, 2006, 97 (3): 477-482.),Pang Pei Kheng (<Xylanase product1n by a local fungal isolate Aspergillusniger USM AIlvia solid state fermentat1n using palm kernel cake as substrate》(Songklanakarin J.Sc1.Technol, 2005, 27(2):325-336)中公开了黑曲霉可用于生产淀粉酶、酸性蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、柠檬酸、葡糖酸和没食子酸等。某些黑曲霉菌株还可将羟基孕留酮转化为雄烯。
[0005]由于黑曲霉在生长繁殖过程中能产生多种代谢酶，且遗传背景清晰，安全可靠，所以被广泛应用于各种植物蛋白源柏类的增值开发。例如，ZL200910272714.7中公开了一株黑曲霉CCTCC No:M209143，该菌株能在以植物纤维作为唯一碳源的基料中生长且生长迅速，纤维素酶的产率高、酶活高。
[0006]目前，本领域仍需要开发棕榈仁柏的新的利用途径以及黑曲霉的新用途，本申请满足了上述需求。
[0007]发明概述
[0008]第一方面，本申请提供了能够以棕榈仁柏作为营养素产生异冰片的黑曲霉(Aspergillus niger)菌株。所述黑曲霉菌株的一个实例是保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(China General Microb1logical Culture Collect1nCenter(CGMCC))、保藏号为CGMCC N0.9069的黑曲霉菌株。本申请还单独提供了保藏于CGMCC、保藏号为CGMCC N0.9069的黑曲霉菌株。
[0009]第二方面，本申请提供了制备异冰片的方法，包括在含有棕榈仁柏的培养基中培养第一方面所述的黑曲霉菌株。在一些实施方案中，该方法还包括从发酵液中分离和/或纯化异冰片。
[0010]第三方面，本申请提供了第一方面所述的黑曲霉菌株在生产异冰片中的用途。
[0011]第四方面，本申请提供了生产异冰片的组合物，所述组合物包含第一方面所述的黑曲霉菌株，还包含棕榈仁柏和黑曲霉培养基中的至少一项。
[0012]第五方面，本申请提供了鉴定能利用生物质产生异冰片的微生物的方法，包括分离所述生物质上生长的微生物，在含有所述生物质的培养基中培养分离出的微生物，并检测培养物中是否存在异冰片。在一些实施方案中，所述生物质是油料作物的柏。在一些实施方案中，所述柏是棕榈仁柏。在一些实施方案中，所述微生物为真菌。在一些实施方案中，所述真菌为曲霉属(Aspergillus)真菌。在一些具体实施方案中，所述真菌为黑曲霉(Aspergillus niger)。
[0013]附图简要说明
[0014]图1显示实施例1中使用的棕榈仁柏样品的示例性照片，本申请的示例性黑曲霉菌株从该棕榈仁柏样品表面生长的菌丝中分离和鉴定。
[0015]图2显示了本申请中分离到的黑曲霉菌株WRD-007的孢子形态图。
[0016]图3显示了发酵前的含5%棕榈仁柏(PKC)的培养基的总离子色谱图。
[0017]图4显示了用黑曲霉菌株WRD-007发酵后的发酵液的总离子色谱图。
[0018]图5显示了发酵前的培养基和发酵后的发酵液中挥发性成分的含量比较。
[0019]发明的详细描述
[0020]本申请部分基于对棕榈仁柏中自然生长的菌落进行分离和鉴定，并令人惊奇地发现能够以棕榈仁柏作为营养素产生异冰片的黑曲霉菌株。由于异冰片对真菌具有杀菌、抑菌的作用，因此发现能产生异冰片的生产宿主是令人意想不到的。
[0021]异冰片(isoborneol),又名异龙脑、异樟醇、异茨醇等,纯品为白色晶体,有类似樟脑的清凉感。
[0022]目前，刘永根(刘永根，合成龙脑的研究，江西师范大学硕士论文，2005)概述了异龙脑主要有两种来源:一种是利用龙脑香科植物龙脑香树的树干经水蒸气蒸馏、冷却而得的晶体，天然龙脑中主要成分是正龙脑，通常只含有微量的异龙脑；另一种是人工合成龙脑，合成龙脑一般是正龙脑和异龙脑的混合物。随着香料和医药工业的发展，龙脑或异龙脑的需求与日俱增，由于天然龙脑提炼和生产的成本高、资源稀缺，满足不了人们对龙脑的需求，陈慧宗等(陈慧宗等，龙脑合成方法的改进，应用化学，2005，22 (5):563-565.)描述了合成龙脑原料易得，价格低廉，但反应中通常需要催化剂(如硼酐、纳米固体超强酸等)，反应控制难度大，易爆炸，产量和得率也不高。
[0023]关于龙脑的生物合成法，印度学者通过富集培养，得到了一种能利用α -菔烯或β -菔烯、双戊烯等作为碳源的绿脓杆菌，该菌能发酵产生龙脑及羧酸。同时，日本学者发现α-松油醇可被某种绿脓杆菌转化为龙脑。
[0024]异冰片具有抗菌作用，作用方式为接触抑菌，在较低浓度时有抑菌作用，高浓度时有杀菌作用，抗菌效果随接触时间的增加而增强。Maria Armaka等(Armaka et.al.Antiviral properties of isoborneol a potent inhibitor of herpes simplex virus typeI, Antiviral research, 1999, 43(2):79-92.)研究发现，异冰片在0.06%的浓度下即能完全抑制单纯疱疹I型病毒复制，并且异冰片可特异性地抑制病毒多肽的糖蛋白。牟家琬等(牟家琬等，龙脑与异龙脑的体外抗菌作用的研究，华西药学杂志，1989，4 (I): 20-22.)发现，异冰片对诸如金黄色葡萄球菌、乙型溶血性链球菌、肺炎链球菌、绿色链球菌和大肠杆菌等临床常见的细菌具有低浓度抑菌、高浓度杀菌的功效。据报道，冰片对黑曲菌等真菌有抑制作用，其作用于真菌细胞壁，使细胞壁通透性增强，从而允许药物进入细胞内，破坏线粒体，导致细胞氧化磷酸化和细胞能量偶联系统被破坏，能量产生降低，导致细胞浆内出现电子空白区，最终导致真菌死亡溶解，从而表现出抑菌杀菌功能。
[0025]除非另外说明，本申请中的术语的含义与本领域技术人员通常理解的含义相同。对于本文中所提到的各项实验技术，本领域技术人员可参考各种教科书、文献以及商业产品说明，也可以参考本申请的实施例部分给出的具体实例。
[0026]应当理解，本文所用的术语“约”(例如，在组分含量和反应参数中)以本领域技术人员通常能够理解的含义来解释。一般情况下，术语“约”可以理解为给定数值的正负5%范围内的任意数值，例如，约X可以代表95% X至105% X的范围中的任意数值。
[0027]还应当理解，本文中给出的具体数值(例如，在组分含量、培养温度和培养时间中)不仅可作为单独的数值理解，还应当认为提供了某一范围的端点值，并且可以相互组合提供其他范围。例如，当公开了某一组分的含量可以为1%或5%时，也相当于公开了其含量可以为1%至5%。
[0028]以下详细描述本申请的一些示例性实施方案。应当理解，这些详细描述仅为了使本领域技术人员更清楚地了解本申请的内容，而并非意图在任何方面加以限制。本领域技术人员能够对所述实施方案进行各种改动和变化。
[0029]第一方面，本申请提供了能够以棕榈仁柏作为营养素产生异冰片的黑曲霉(Aspergillus niger)菌株。所述黑曲霉菌株的一个实例是保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(China General Microb1logical Culture Collect1nCenter(CGMCC))、保藏号为CGMCC N0.9069的黑曲霉菌株。本申请还单独提供了保藏于CGMCC、保藏号为CGMCC N0.9069的黑曲霉菌株。该菌株在本申请中所指定的编号为WRD-007。该菌株已于2014年4月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号楼)，保藏号为CGMCC N0.9069。关于该菌株的分离、纯化、检测和鉴定过程，在后文的实施例中有详细描述。由于冰片类对于真菌具有抑菌、杀菌活性，因此能够利用黑曲霉作为生产宿主来产生异冰片的发现是令人意想不到的。
[0030]该菌株的整体形态学特征包括:初始培养时，菌丝为白色、绒毛状，菌落中间突起(培养24h)，向四周辐射生长，菌落中央的菌丝渐变为黑色，非常厚密(培养48h);分生孢子为黑色，数量极多。该菌株的显微镜形态特征包括:菌丝长且致密，菌丝梗光滑；分生孢子头呈辐射状，直径约为200 μ m,分生孢子梗茎约为Imm ;顶囊近球形，直径20-30 μ m,分生孢子呈球形，黑褐色。
[0031]第二方面，本申请提供了制备异冰片的方法，包括在含有棕榈仁柏的培养基中培养第一方面所述的黑曲霉菌株。在一些实施方案中，该方法还包括从发酵液中分离和/或纯化异冰片。
[0032]棕榈仁柏是制油工业的常见副产品，可以商购获得。在一些实施方案中，将棕榈仁柏磨成粉后添加到培养基中。在一些实施方案中，培养基中棕榈仁柏的含量为约l_15w/w.%，例如约 l、2、3、4、5、6、7、8、9、10、ll、12、13、14、15w/w.%0
[0033]适合于黑曲霉的培养条件(例如培养基类型、培养温度、培养时间等)是本领域技术人员所公知的。可以向适合于培养黑曲霉的基础培养基或常规培养基中添加合适量的棕榈仁柏来制备本申请的培养基。也可以将棕榈仁柏作为唯一营养素来制备培养基。适合于培养黑曲霉的培养基的一个非限制性实例为PDA(potato dextrose agar)培养基。在一些实施方案中，培养温度为约26-30°C，例如约26、27、28、29、30°C。在一些实施方案中，培养时间为约12-72小时，例如约12、24、36、48、72小时。在一些实施方案中，培养基中菌株孢子的接种量为约 l-10w/w.%，例如，约 l、2、3、4、5、6、7、8、9、10w/w.%0
[0034]从发酵液中分离和/或