专利名称：一种黑曲霉菌株及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种微生物及其应用，尤其是一种黑曲霉(Aspergillus niger)菌株 及其应用。
背景技术：
利用非病原性的微生物在农作物秸秆、农副加工产品及有机垃圾等基质上进行大 规模培养而获取蛋白质，是食品工业和饲料工业的重要蛋白质来源；虽然人们长期以来对 其进行了大量的研究，但迄今为止，还没有把来源广泛且廉价的农作物秸秆和各种农副产 品转化为蛋白质形成规模化、产业化，其根本问题之一是没有培养出在生产上大量应用的 高产纤维素酶活的优良菌株。大量研究已经证实了空间特殊条件是微生物诱变育种的良好 方法，目前虽然对利用各种途径筛选出的高纤维素酶活的菌株已有报道，但由于试验菌种 的本身效价较低，即使其酶活提高百分之几十，还不及生产菌种的效价高，所以还不能在生 产上发挥作用。
利用微生物进行高密度培养是将纤维质转化为蛋白质的一条重要方式，它是指微 生物在液体培养基中细胞群体密度超过常规培养10倍以上时的生长状态或培养技术，若 能提高微生物的培养密度，提高产物的比生产率，不仅可减少培养容器的体积和培养基的 消耗、提高“下游工程”中分离、提取的效率，而且还可缩短生产周期、减少设备投入和降低 生产成本，因此具有重要的生产实践价意义。但是，由于人们对其研究时间较短，理论研究 还有待于深入，目前被研究过的微生物种类还很有限，主要局限于大肠杆菌(E. coli)和啤 酒酵母(S. cerevisiae)等少数兼性厌氧菌上，至今未见利用好氧性的黑曲霉进行高密度 培养的报道。
黑曲霉是目前公认的安全菌株，它产生的纤维素酶活较高且酶系较全，尤其能分 泌极高的β -葡萄糖苷酶酶活，是降解纤维素的优良菌株，但利用航天诱变技术对其进行 筛选高效价比的优良菌株还未曾见报道。发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种黑曲霉菌株，该菌株具有较高的纤维素酶 活力，并通过该菌株生产食品蛋白和饲料蛋白。
为解决上述技术问题，本发明采用技术方案的基本构思是
提供一种黑曲霉菌株
黑曲霉ZM-8 (Aspergillus niger ZM-8)菌株，已按专利法实施细则第二十五条的 规定在国家知识产权局认可的保藏单位保藏，保藏日期2009年6月10日；保藏单位名称 及简称中国典型培养物保藏中心，CCTCC ；保藏编号CCTCC NO :M209125。
该菌株的微生物学特性表现为该菌株在刚果红-羧甲基纤维素琼脂培养基上 透明圈直径与菌落直径之比为1. 8 2. 2 ；在察氏平板培养基上培养，菌落表面的菌丝体 白色，厚绒状，质地疏松，孢子灰黑色，在整个表面密集生长，分布均勻，菌落反面白色，平坦；在显微镜下观察，其分生孢子梗自基质生出，长短较为均一，大多数为1. 5mm 2mm，顶 囊球形，直径为35 μ m 50 μ m，小梗双层，自顶囊全面着生，梗基长为15 μ m 20 μ m，宽 为3μπ 4μ ，无横隔，小梗长为5μπ 7μ ，宽为2μπ 3μ ，分生孢子球形，直径为 4. 5 μ m 5 μ m。
黑曲霉CCTCC NO :M209125菌株的应用
将所述黑曲霉制成1. OX IO9 3. OX 101°个孢子/L的悬浮液，再将该悬浮液以 50 100mL/L的接种量接入包括碳源、麸皮和无机盐的培养基20°C 35°C浅盘恒温培养2 天 7天，所述培养采用纯氧方式，所述碳源包括苹果渣，或玉米秸秆粉，或小麦秸秆粉。
可选的，所述培养基成分按质量kg/体积L的百分比计，为苹果渣5^-8%, 麸皮1 % 5 %，磷酸铵0. 1 % 1. 0 %，磷酸二氢钾0. 05 % 0. 2 %，硫酸镁0. 01 % 0. 05%，硫酸铁0. 001% 0. 005%。
可选的，所述培养基成分按质量kg/体积L的百分比计，为玉米秸秆粉3% 7%，麸皮 5%，磷酸铵0. 1.0%，磷酸二氢钾0. 05% 0.2%，硫酸镁 0. 01% 0. 05%，硫酸铁0. 001% 0. 005%。
可选的，所述培养基成分按质量kg/体积L的百分比计，为小麦秸秆粉2% 5%，麸皮 5%，磷酸铵0. 1.0%，磷酸二氢钾0. 05% 0.2%，硫酸镁 0. 01% 0. 05%，硫酸铁0. 001% 0. 005%。
其中，所述培养基用自来水配制，初始pH值4. 0 7. 0。
本发明的有益效果是，本发明筛选得到的黑曲霉CCTCC N0:M209125菌株在以玉 米秸秆粉为碳源的固体培养基上所产FPU (滤纸酶活力)、CMC (纤维二糖水解酶活力)、 C1(葡聚糖内切酶活力)和i3-GlaSe(i3-葡萄糖苷酶活力)分别达到了 58U/g、1176U/g、 96U/g和72486U/g(在一定的pH、温度等反应条件下，每小时由底物生成Ιμπιο 葡萄糖所 需的酶量定义为W ；迄今为止，曾报道过的FPU的最高酶活力为19U/g，CMC的最高酶活力 为908. 2U/g，β -Glase的最高酶活力为141649U/g ；对玉米秸杆中纤维素、半纤维素和木 质素的降解率分别为20. 92%,23. 99%和1. 04% ；酶解得糖率为19. 30% ；同时，在以苹果 渣、玉米秸秆粉和小麦秸秆粉为主要碳源的液体培养基中，其成膜性分别达到了 32mm、25mm 和19mm，其中浅盘深度为40mm，所装培养液的深度为35mm ；其高密度值g (湿重)/L分别 为406. 4,358. 2和307. 5，至今已报道过的高密度生长的实际最高纪录为E. coli W330的 174g(湿重)/L和E. coli用于生产PHB (聚羟基丁酸酯)的“工程菌”的175. 4g(湿重)/ L0
所述黑曲霉ZM-8 (Aspergillus niger ZM-8)菌株，已按专利法实施细则第二十五 条的规定在国家知识产权局认可的保藏单位保藏，保藏日期2009年6月10日；保藏单位 名称及简称中国典型培养物保藏中心，CCTCC ；保藏编号CCTCC NO :M209125。
具体实施方式
实施例1
黑曲霉CCTCC NO :M209125菌株的选育
1、航天诱变
按照培育目标，选择本身具有较高效价比的黑曲霉搭载于返回式航天器上，使其在空间特殊的环境条件诱变下发生变异。当航天器返回地面后，取出搭载的出发黑曲霉，保 存于马铃薯斜面培养基，以待进行微生物学特性研究和优良菌株的筛选。
2、微生物学特性
航天诱变黑曲霉CCTCC NO :M209125菌株的微生物学特性表现为该菌株在刚果 红-羧甲基纤维素琼脂培养基上透明圈直径与菌落直径之比为1.8 2. 2;在察氏平板 培养基上培养，菌落表面的菌丝体白色，厚绒状，质地疏松，孢子灰黑色，在整个表面密集 生长，分布均勻，菌落反面白色，平坦；在显微镜下观察，其分生孢子梗自基质生出，长短较 为均一，大多数为1. 5mm 2mm，顶囊球形，直径为35 μ m 50 μ m，小梗双层，自顶囊全面 着生，梗基长为15μπι 20μ ，宽为3μπι 4μ ，无横隔，小梗长为5 μ m 7 μ m，宽为 2 μ m 3 μ m，分生孢子球形，直径为4. 5 μ m 5 μ m。
3、黑曲霉CCTCC NO :M209125菌株的筛选
先利用常规方法对该菌种活化、平板分离，然后挑取在平板培养基上生长旺盛的 单菌落分别接种于盛滤纸条培养基的试管中，于20°C 35°C恒温培养24h 72h，然后将显 示有滤纸降解的菌株作系列稀释，在刚果红-羧甲基纤维素琼脂培养基上作平板分离，挑 有HC > 1单菌落接种于察氏斜面培养基保藏，以备复筛。复筛时，将初筛的试验菌株自斜 面培养基上挑取斜面培养物约3mm2 5mm2接种于种子培养基上，用无菌玻璃棒压碎，并与 培养基搅勻，20°C 35°C恒温培养24h 72h，按固体曲质量比1 5 1 10的接种比 接入基础产酶培养基上进行培养，20°C 35°C恒温培养24h 7 后测纤维素酶系的各酶 活、得糖率和培养产物成分。
所述种子培养基成分按质量kg/体积L的百分比，为玉米秸秆粉20% 50%， 硫酸铵0. 5 % 2 %，硫酸镁0. 01 % 0. 05 %，磷酸二氢钾0. 002 % 0. 012 %，用蒸馏 水配制。
所述基础产酶培养基成分按质量kg/体积L的百分比，为玉米秸秆粉40% 85 %，麸皮15 % 60 %，磷酸铵0. 5 % 2 %，硫酸镁0. 01 % 0. 05 %，磷酸二氢钾 0. 002% 0. 012%，用自来水配制。
测定结果表明，初筛的几株突变菌株的各酶活与出发菌株相比，都有不同程度的 提高，其中黑曲霉ZM-8菌株纤维素酶活力的提高幅度最大，FPU(滤纸酶活力)、CMC(纤维 二糖水解酶活力KC1(葡聚糖内切酶活力)和i3-GlaSe(i3-葡萄糖苷酶活力)比出发菌株 依次提高了 2. 1倍、3. 5倍、1. 7倍和1. 8倍，几株复筛菌株的各组分酶活力均极显著高于或 显著高于出发菌株，其中黑曲霉ZM-8菌株的各组分酶活力均极显著高于或显著高于其他 各复筛菌株，因此确定黑曲霉ZM-8为最终所筛选的高产纤维素酶活菌株，即黑曲霉CCTCC NO :M209125 菌株。
实施例2
黑曲霉CCTCC NO :M209125菌株的应用
将所述黑曲霉的斜面孢子用无菌生理盐水洗脱，制成1. OX IO9 3. OX 101°个 孢子/L的悬浮液，再将该悬浮液以50 100mL/L的接种量接入培养基，20°C 35°C浅盘 恒温纯氧培养2天 7天；所述培养基成分按质量kg/体积L的百分比计，为苹果渣 5% 8%，麸皮 5%，磷酸铵0. 1.0%，磷酸二氢钾0. 05% 0.2%，硫酸镁 0. 01% 0. 05%，硫酸铁0. 001% 0. 005%，用自来水配制，初始pH值4. 0 7. 0。
实施例3
黑曲霉CCTCC NO :M209125菌株的应用
与实施例2相比仅在于培养基不同。本实施例的培养基成分按质量kg/体积L的 百分比计，为玉米秸秆粉3% 7%，麸皮 5%，磷酸铵0. 1.0%，磷酸二氢 钾0. 05% 0. 2%，硫酸镁0. 01% 0. 05%，硫酸铁0. 001% 0. 005%。
实施例4
黑曲霉CCTCC NO :M209125菌株的应用
与实施例2相比仅在于培养基不同。本实施例的培养基成分按质量kg/体积L的 百分比计，为小麦秸秆粉2^-5^1^8:1%- 5%，磷酸铵0. 1.0%，磷酸二氢 钾0. 05% 0. 2%，硫酸镁0. 01% 0. 05%，硫酸铁0. 001% 0. 005%。
权利要求
1.一种黑曲霉ZM-8 (Aspergillus niger ZM-8)菌株，其特征在于，该菌株的保藏编号 为CCTCC NO :M209125，该菌株在刚果红-羧甲基纤维素琼脂培养基上透明圈直径与菌落 直径之比为1.8 2.2 ；在察氏平板培养基上培养，菌落表面的菌丝体白色，厚绒状，质地疏 松，孢子灰黑色，在整个表面密集生长，分布均勻，菌落反面白色，平坦；在显微镜下观察，其 分生孢子梗自基质生出，长短较为均一，大多数为1. 5mm 2mm，顶囊球形，直径为35 μ m 50 μ m，小梗双层，自顶囊全面着生，梗基长为15口111 2(^111，宽为3口111 4口111，无横隔，小 梗长为5 μ m 7 μ m，宽为2 μ m 3 μ m，分生孢子球形，直径为4. 5 μ m 5 μ m。
2.一种黑曲霉CCTCC N0:M209125菌株的应用，其特征在于，将该黑曲霉制成 1.0X109 3. OX 101°个孢子/L的悬浮液，再将该悬浮液以50mL/L 100mL/L的接种量接 入包括碳源、麸皮和无机盐的培养基20°C 35°C浅盘恒温培养2 7天，所述培养采用纯 氧方式，所述碳源包括苹果渣，或玉米秸秆粉，或小麦秸秆粉。
3.根据权利要求2所述的黑曲霉CCTCCN0:M209125菌株的应用，其特征在于，所 述培养基成分按质量kg/体积L的百分比计，为苹果渣5^-8^1^8 :1% 5(%，磷 酸铵0. 1.0%，磷酸二氢钾0. 05% 0.2%，硫酸镁0. 01% 0. 05%，硫酸铁 0. 001% 0. 005%。
4.根据权利要求2所述的黑曲霉CCTCCN0:M209125菌株的应用，其特征在于，所述 培养基成分按质量kg/体积L的百分比计，为玉米秸秆粉3 % 7 %，麸皮1 % 5 %， 磷酸铵0. 1.0%，磷酸二氢钾0. 05% 0.2%，硫酸镁0. 01% 0. 05%，硫酸铁 0. 001% 0. 005%。
5.根据权利要求2所述的黑曲霉CCTCCN0:M209125菌株的应用，其特征在于，所述 培养基成分按质量kg/体积L的百分比计，为小麦秸秆粉2 % 5 %，麸皮1 % 5 %， 磷酸铵0. 1.0%，磷酸二氢钾0. 05% 0.2%，硫酸镁0. 01% 0. 05%，硫酸铁 0. 001% 0. 005%。
6.根据权利要求2或3或4或5所述的黑曲霉CCTCCNO :M209125菌株的应用，其特 征在于，所述培养基用自来水配制，初始pH值4. 0 7. 0。
全文摘要
本发明公开了一种黑曲霉菌株，该菌株具有较高的纤维素酶活力，并通过该菌株生产食品蛋白和饲料蛋白。该菌株是黑曲霉ZM-8(Aspergillus nigerZM-8)菌株，保藏编号CCTCC NOM209125；黑曲霉CCTCC NOM209125菌株的应用将所述黑曲霉制成1.0×109～3.0×1010个孢子/L的悬浮液，再将该悬浮液以50～100mL/L的接种量接入包括碳源、麸皮和无机盐的培养基20℃～35℃浅盘恒温培养2天～7天，所述培养采用纯氧方式，所述碳源包括苹果渣，或玉米秸秆粉，或小麦秸秆粉。
文档编号C12R1/685GK102031226SQ20091017962
公开日2011年4月27日 申请日期2009年10月6日 优先权日2009年10月6日
发明者张宗舟, 马旭光, 黄高宝 申请人:张宗舟, 马旭光, 黄高宝