一种提高微生物抗逆性的方法

专利名称：一种提高微生物抗逆性的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域中一种调控微生物代谢及提高微生物抗逆性的方法。
背景技术：
聚羟基脂肪酸酯(Polyhydroxyalkanoate或PHA)是许多种类的细菌都能合成的一种细胞内聚酯，在生物体内主要是作为细胞内碳源和能源的贮藏性物质而存在的
(Xemoigne M. Products of dehydration and of polymerization of -hydroxybutyricacid. Bull. Soc. Chem. Biol., 1926， 8: 770-782) 。 PHA的结构通式如
<formula>formula see original document page 3</formula>(式I)
其中n可以为l、 2、 3或4,『l时表示3—羟基脂肪酸酯；m为聚合度；R为可变的侧链基团，如饱和或不饱和、直链或含侧链及取代基的不同链长的烷基。根据PHA侧链的长短不同，可将PHA分为三种类型
(1) 短链raA (short-chain-length PHA， scl PHA)，如聚羟基丁酸酯(polyhydroxybutyrate, PHB)、羟基丁酸酯与羟基戊酸酯的共聚物[poly(hydroxybutyrate-co-hydroxyvalerate), PHBV]，单体含3-5个碳原子。
(2) 中长链PHA (medium-chain-length PHA， mcl PHA)，如聚羟基己酸酯(PHHx)、聚羟基辛酸酯(PH0)，单体含6个以上碳原子。mcl PHA中可以含有多种功能基团，如双键(Huigberts GNM， Eggink G， Waard P, Huisman GW and Witholt B. Pseudomonas putitaKT2442 cultivated on glucose accumulates poly—P-hydroxyalkanoates consistingof saturated and unsaturated momnomers. 4pp7 f"Kr肌#icroW. ， 1992，58:536-544)、畚键、卣素(Doi Y and Abe C. Biosynthesis and characterization ofa new bacterial copolyester of 3-hydroxyalkanoates and
3-hydroxy-w-chloroalkanoates. ifecrtM7。7ec〃7e51, 1990， 23:2705-3707)、酚(FritzscheK, Lenz RW and Fuller RC. An unusual bacterial polyesters with a phenyl pendantgroup. #acro/z o7 1990, 191:1957-1968)和氰(Schulz C， Wolk S， Lenz RW and
Fuller RC. Growth and polyester production by /!sei/ob7 7o朋51 o7eorara"s on branchedoctanoic acid substrates. 飽cr。/z7oJecw7e51. 1995, 27:6358-6362)等。mcl PHA大多是两种以上单体的随机共聚物。
(3) 含短链与中长链单体的PHA,多是两种或两种以上单体的随机共聚物(UgeveenRG, Huisman GW, Preusting H， Ketelaar H， Eggink G and Witholt B. Formation ofPolyesters by尸sei/c/cyz70/ 351 aZeorara/ s: Effect of Substrates on formation andcomposition of poly-(R)-3-hydroxyalkanoates and poly-(R)-3_ hydroxyalkenoates.^ p丄#icroW, 1988， 54:2924-2932)。
PHA对于细菌适应外界环境的变化及生存具有重要的意义。以PHB为例，有些细菌胞内的PHB可以减缓细胞内重要成分一RNA和蛋白质在饥饿条件下的降解，从而可以增加细菌对生存逆境的抵抗能力。另外在某些芽孢杆菌属中，尽管孢子的形成并不必需PHB，但P朋可以作为孢子形成时的能源和碳源从而增加这些菌的生存机会。此外，PHB还可以为某些固氮菌属的包囊形成提供必要的碳源和能源。对^^zoZ^'"//7 sp. ORS 571的固氮与PHB的形成及降解的研究表明，当节结中的氧浓度增加时，P朋可以通过自己的降解保护固氮酶不受损伤(Anderson AJ and Dawes EA. Occurense， Metabolism, Metabolic Role,and Industrial Use of Bacterial Polyhydroxyalkanoates. #/c_roZ>. /PeK. ， 1990，54:450-472)。
PHA还可以作为环境的标记。在对河湾沉积物中的微生物进行的研究表明，通过比较其中磷脂和PHA的合成比例，可以监测外界因素对沉积物的影响程度。而且许多可合成PHA的细菌都是在活性污泥、及富含碳源有机物的环境中被筛选出来的。在对一些被原油污染严重的地方分离的嗜冷海洋微生物进行的研究表明，其中的大多数微生物都可以在限氮的条件下在胞内积累PHA (Alvarez HM， Pucci OH and Steinbtlchel A. Lipid storagecompounds in marine bacteria. Appl. Microbiol. Biotechnol., 1997, 47: 132-139)。这说明在这些碳源较丰富的环境中大多数细菌都具备将过量的碳源转化为PHA储存起来的能力。
PHB是细菌胞内的碳源和能源的储备物。但近来发现它也存在于原核生物和真核生物的膜中。在原核生物中，它存在于其原生质膜中；而在真核生物中，则以在线粒体和微体膜中的比例为最多。相比于胞内的高分子量的聚合物，存在于膜上的PHB分子较小，只有100—200个单体。对这种小分子量PHB的研究表明，它可能起着膜上的离子通道的作用。最近，在人的血细胞中也发现较多量的这种小分子PHB。这对于利用PHB来包裹药物进行定向定量释放以及PHA在医疗方面的应用提供了理论上的依据。
PHA作为一种生态型的生物高分子材料，不仅可以在塑料工业中得以推广和应用，成为新型的生物可降解塑料，而且由于它的一些特殊性质，如生物相容性、光学活性、压电性、气体相隔性等和其它许多尚未发现的性质，从而有可能在某些高附加值领域得以应用。对PHA的研究已经成为一个基础理论与实践应用结合得非常紧密的应用领域。
不同类型PHA在细菌内的合成途迳是不同的，目前已知的合成途径主要有三条(Anderson AJ and Dawes EA. Occurense, Metabolism, Metabolic Role, and IndustrialUse of Bacterial Polyhydroxyalkanoates. WoroZ . /Per., 1990, 54:450-472; Lee SY.Bacterial Polyhydroxyalkanoates. 历-otec/ . 历'oe/ g. 1996， 49:1-14):
1. 以Vai/ter57'3 ei/t/Y p力s (以前叫y a_/5^o/3J'3 ei/tr。;7/73， 也叫力7ca力^e/7e51e"tr砂/ "s)为代表的由乙酰辅酶A直接合成PHB途径它的PHB合成酶系统由pha合成操纵子p/^O9(SEQIDN0:l)基因编码，包含三种酶p-酮基硫解酶((3-ketothiolase)、 NADra依赖的乙酰乙酰辅酶A还原酶(acetoacyl-CoA reductase)和PHB合成酶(P朋 synthase);上述三种酶分别由p/ 6A p/ 力5和； /^C基因编码，且位于同一个操纵子上。 细胞内的代谢中产物乙酰辅酶A在l3-酮基硫解酶(p-ketothiolase， PhaA)的催化作用 下形成乙酰乙酰辅酶A，然后在NADPH依赖的还原酶(PhaB)的作用下还原为(R)-羟基丁 酰辅酶A， (R)-羟基丁酰辅酶A在PHB合成酶的作用下聚合成PHB。这个过程需要消耗 NADPH，产生NADP。
2. 以/^e"c^70/ asaei7^7'/70sa为代表的脂肪酸从头合成途径从这条途径合成PHA 需要两个酶的催化p力a(7编码的3—羟酰基一酰基转移蛋白辅酶A转运酶
(3-Hydroxyacyl-ACP-CoA transferase)和p/ aC编码的PHA合酶。脂肪酸从头合成途 径的中间产物3—羟酰基一酰基转移蛋白由3—羟酰基一酰基转移蛋白辅酶A转运酶
(PhaG)催化形成PHA的前体3-羟基酯酰辅酶A，再由PHA合酶聚合成PHA。同样的途径 有恶臭假单胞菌(/^ew/湖o朋s/7"j'te)的合成途径，恶臭假单胞菌(/^e"ob历o朋sta) 的PhaG的编码基因的Genbank检索号是AF052507。
3. 以/^e"(/o/TO/7as a/eorara/w为代表的0—氧化途径从这条途径合成PHA需要 两个酶的作用p力a/编码的(R) —烯酰基一水合酶((R) -enoyl-CoA hydratase)和 p力aC编码的PHA合酶。脂肪酸(3-氧化的中间产物烯酰基一酰基转移蛋白由(R) —烯酰 基一水合酶(PhaJ)催化形成PHA的前体3-羟基酯酰辅酶A，再由PHA聚合酶聚合成PHA。 同样的途径有嗜水气单胞菌(力ero/z o/ as力/rfr叩力j7a)的合成途径，嗜水气单胞菌 "aro/770/ as Arrfro; /w'7a)的PHA合成酶操纵子(PHA synthase operon)编码基因的Genbank 检索号是AY093685,包括PhaJ和PhaC的编码基因。
用13C-NMR对/^e"ob历o朋s 的脂肪酸合成的研究表明脂肪酸的从头合成和P
_氧化与PHA合成是独立进行的(Huijberts GN， De Rijk TC， De Waard P and Eggink G.. 13C nuclear magnetic resonance studies of Pseudomonas putidas fatty acids metabolic routes involved in PHA syntheses. /- fecterio7. /卯《77(5.. 76(57-7( 鄉， 在一种细菌中可能会同时以二种途径来合成中长链PHA，虽然这二种途径并不是均等地起 作用。最近的研究发现这两条途径之间也有联系，可以将脂肪酸从头合成途径的中间产 物acyl-ACP在一个硫酯酶的作用下转变为降解途径的中间产物acyl-CoA (Rehm BHA and Steinbtlchel A. Heterologous expression of the acyl-acyl carrier protein thioesterase gene from the plant UmbelluLaxia californica mediates polyhydroxyalkanoates biosynthesis in recombinant ￡sc/ eric/ _z'<3 co7义 4PP丄 Wcro6j'o/. A'otec/y o/. 2001, 55:205-209)。这个新发现表明PHA合成的单体提供途 径是很多样化的，而对PHA合成进行代谢工程的研究也有更多的选择。
在PHA的代谢途径中，既有能量的代谢(NAD/NADH,NADP/NADPH等)，也有物质的 代谢(乙酰辅酶A，脂肪酸等)，因此PHA的代谢过程，实际上也是一个细胞内能量和物 质的改变过程。由于PHA可以广泛的存在于各种细胞中，这也为将PHA合成机制作为调节手段在各种不同的微生物中调节其能量和物质水平，进而影响代谢产物提供了基础。

发明内容
本发明的一个目的是提供一种调控微生物代谢的方法。
本发明所提供的调控微生物代谢的方法，是在微生物中合成聚羟基脂肪酸酯；所述聚羟基脂肪酸酯的合成是通过在所述微生物中引入聚羟基脂肪酸酯合成途径的相关基因而实现的。
所述代谢包括能量和物质代谢。
所述聚羟基脂肪酸酯合成途径的相关基因选自下述l) ， 2)和3)中的任意一种1) p力力C^基因，2) / / aC禾t];7力aC基因，3) p力a/和p力aC基因。
所述p力力C^基因优选为具有序列表中SEQ ID N0:1的DNA序列；所述尸力aG基因优选为AF052507，所述p力aC基因优选为来自于AY093685，所述p力s/基因优选为来自于AY093685。
PHA合成途径的相关基因可以通过本领域的常规手段导入宿主微生物中，例如，可以利用表达载体如质粒、粘粒、噬菌体等，通过转化、转导、接合等手段导入宿主微生物中；也可以利用原生质体融合等手段来实现。
所述调控微生物代谢为调控微生物对发酵产物的生产能力。
所述微生物为细菌，古细菌和真菌；所述发酵产物包括有机酸，醇类，抗生素，氨基酸和维生素。
其中，所述微生物可为兽疫链球菌(5Yr印"cocc"s加oe/^Ve/w'c"s )，优选为兽疫链球菌(5"tre/ Z^cocci/s zooejW'ofe肌'ci/s ) ATCC 39920，所述发酵产物为乳酸和透明质酸；
所述微生物可为光滑球拟酵母(7b/Yy7叩w's ^aZ^ats)，优选为光滑球拟酵母(7br〃7o;wis g7a6rate) CCTCCM202019，所述发酵产物为丙酮酸；
所述微生物可为酿酒酵母(&cc力ar咖7ces cerew'siae)，优选为酿酒酵母(5"acc力ar卿yces cerew'w'ae) IFFI 01338，所述发酵产物为麦角固醇；
所述微生物可为枯草芽孢杆菌(5a"77M sM"7is )，优选为枯草芽孢杆菌(泡"77"s s"力"7^ ) ATCC 19162,所述发酵产物为肌苷；
所述微生物可为嗜碱芽孢杆菌(53cW7m a7ca7op/^'7"s)，优选为嗜碱芽孢杆菌(&cj'77"s a7ca7o; /l 7"s) Ya-B，所述发酵产物为弹性蛋白酶；
所述微生物可为红酵母(^oGbto/777a ^"^'/7is)，优选为红酵母(y 力oobtor"hW〃""/5") NCIM 3353，所述发酵产物为类胡萝卜素；
所述微生物可为谷氨酸棒杆菌(Opr"eybacZ^r/iy/z7 ^i/ta啦'c"历)，优选为谷氨酸棒杆菌(Cbrj/7e6acteriMZ7 ^7i/ta/w'cM ) ATCC 13032，所述发酵产物为谷氨酰胺；
所述微生物可为乳酸发酵短杆菌(&ew'6actew'咖7acz^/kr鹏/7t鹏)，优选为乳酸发酵短杆菌(5repa'力sc&r/湖^"o/er鹏/ z^7 ) ATCC 31269，所述发酵产物为赖氨酸；
所述微生物可为大肠杆菌(￡scAe_r/c/ i'a.coh')，优选为大肠杆菌 (&c/ erj'c/n'a. coh') ATCC 31882，所述发酵产物为苯丙氨酸；
所述微生物可为荧光假单胞菌(/^e"ob历o"ss/7"oresce/^)，优选为荧光假单胞菌 (/^e〃ob/770朋s /7〃ore"e/w) AS 1.55，所述发酵产物为葡萄糖酸；
所述微生物可为枯草芽孢杆菌(Sacj7hs卯&ih's )，优选为枯草芽孢杆菌 (7feciJAAs w力ti7is ) ATCC 21556，所述发酵产物为a -淀粉酶；
所述微生物可为酿酒酵母(&cc力aro/^ces cerew、/ae )，优选为酿酒酵母 (&cc/ aro历yces cereWw'se ) ACCC 2063，所述发酵产物为乙醇；
所述微生物可为克鲁斯假丝酵母(Ca/7力Va Ai^sw'),优选为克鲁斯假丝酵母 (C朋力Va hv/sei ) ACCC 2196，所述发酵产物为甘油；
所述微生物可为热带假丝酵母(&77W^ z^印ics"'s )，优选为热带假丝酵母 z^ropicah's ) UH22248，所述发酵产物为十二碳二元酸；
所述微生物可为热带假丝酵母(&/7力'^ ^x;pi"7/s )，优选为热带假丝酵母 (C朋力Va tr叩ica乃's ) TV14，所述发酵产物为十五碳二元酸；
所述微生物可为枯草芽孢杆菌(泡c^7m s^^7is )，优选为枯草芽孢杆菌 (few77"s s〃力"7is ) ATCC 19220，所述发酵产物为鸟苷；
所述微生物可为酿酒酵母(6^cc/ aro/ZLKces cerew'w'ae )，优选为酿酒酵母 (5"acc/ aro/^ces cerew'w'ae ) KY6186，所述发酵产物为谷胱甘肽；
所述微生物可为球拟酵母(7brY^o/ w's sp)，优选为球拟酵母(rar^oA^'s sp) B845， 所述发酵产物为赤藓糖醇；
所述微生物可为短小芽孢杆菌(^a" 7t/spu加'7us )，优选为短小芽孢杆菌(J5aw7"s ;^加7m ) ATCC 31095，所述发酵产物为D-核糖；
所述微生物可为丁酸梭芽孢杆菌(67ostriA'咖Zwfyn'ci/历)，优选为丁酸梭芽孢 杆菌(aostrj'rf/咖to0^j'c咖)ATCC 8260，所述发酵产物为1， 3-丙二醇；
所述微生物可为荧光假单胞菌(/^e"ob历OT7as/7"oresce/^)，优选为荧光假单胞菌 (尸se〃cto历o朋s /7f/aresce/ s) AS 1.55，所述发酵产物为葡萄糖酸；
所述微生物可为枯草芽孢杆菌(5acL J^ s"&iJis ),优选为枯草芽孢杆菌 (feci77"s s"力"'7A ) ATCC 19162，所述发酵产物为肌苷；
所述微生物可为移动假单胞菌(》朋o历o/7as历o&'7A )，优选为移动假单胞菌 (^y/ro/zw;7as /zra&7^ ) NRRL B-4286，所述发酵产物为乙醇。 本发明的另一个目的是提供一种提高微生物抗逆性的方法。
本发明所提供的提高微生物抗逆性的方法，是在微生物中合成聚羟基脂肪酸酯；所 述聚羟基脂肪酸酯的合成是通过在所述微生物中引入聚羟基脂肪酸酯合成途径的相关基因而实现的。
所述聚羟基脂肪酸酯合成途径的相关基因选自下述l) ， 2)和3)中的任意一种1)p力力C^基因，2) / A^7和p/ aC基因，3)如a/和/ / aC基因。
所述/ 力Z^^基因优选为具有序列表中SEQ ID NO: 1的DNA序列；所述尸力a"基因优选为AF052507，所述p力aC基因优选为来自于AY093685，所述p/ a/基因优选为来自于AY093685。
其中，所述方法中，所述微生物可为酿酒酵母(5"acc/ aroy7i7ces cereK/siae)，优选为酿酒酵母(5"acc/ ^YM yces careKy^'ae) ACCC 2063，所述逆境胁迫为冷胁迫或热胁迫；
所述微生物可为大肠杆菌(^^c力eric/^a coh')，优选为大肠杆菌(E9C力eric力j'a) JM109，所述逆境胁迫为重金属离子胁迫；所述重金属离子可为Hg2+;
所述微生物为移动假单胞菌(i)wo/z7朋asM^i7")，优选为移动假单胞菌(^>// 0历朋35//70&7i's ) NRRL B-4286，所述逆境胁迫为低pH胁迫或高渗透压胁迫；
所述微生物可为嗜酸乳杆菌(Zscto^^7^s aw'obp/ j7"s )，优选为嗜酸乳杆菌"acto6acW7"s aciobp/ i7〃s ) ATCC 53671，所述逆境胁迫为低pH胁迫；
所述微生物可为芽孢杆菌，优选为苏云金芽孢杆菌(Aaw77"s t/ "r^^'e/ w's )，尤其优选为苏云金芽孢杆菌(5aci77"s t/wr//^7'e/^ys ) ACCC 10068;
所述微生物可为芽孢杆菌，优选为芽孢杆菌(5a"'77"s sp) L-23;所述逆境胁迫为原油胁迫。
本发明通过引入PHA合成基因，使微生物本身的代谢得到调控，提高了对逆境胁迫的抗性。
所述PHA合成机制包括以Wautersia eutropha， Rhodospirillum rubrum为代表的由乙酰辅酶A直接合成PHB途径；以Pseudomonas aeruginasa为代表的脂肪酸从头合成途径，以Pseudomonas oleovorans为代表的脂肪酸P—氧化途径等。
在本发明的调控微生物代谢及提高微生物抗逆性的方法中，可将PHA合成的相关基因克隆到针对于目的菌的质粒载体上，将构建的质粒导入到目的菌中获得重组菌，发酵重组菌获得所需的产物或提高抗逆性。PHA合成的相关基因可以在质粒上或染色体上。
为提高转化效率，将重组质粒表达载体导入目的菌中的方法优选为电转化法，但也可以采用其它生物工程领域中常用的方法，包括热激法、原生质体转化法和接合转化法。
本发明通过在微生物重组生产菌中引入PHA合成途径，调节了细胞内的NAD(P)/NAD(P)H代谢以及乙酰辅酶A，丙酮酸等中间代谢产物的流向，为所需的发酵产物提供可调节的合成环境，同时PHA的积累能提高重组生产菌对恶劣环境的耐受力，特别是产物的反馈抑制，也有利于提高发酵产量的提高。
本发明利用PHA合成路径调节微生物代谢，提高微生物发酵产物的生产效率，进一步提高微生物抗逆性。本发明提供的方法是构建含有PHA合成相关基因的质粒，在导入相应 菌株中进行表达。所述的菌株可以为各种微生物生产菌。将本发明的方法应用到各种微 生物生产菌中，可以有效的影响生产菌的代谢途径，增加菌的抗逆性，提高包括透明质 酸、丙酮酸、麦角固醇、啤酒、肌苷、弹性蛋白酶、类胡萝卜素、谷氨酰胺、赖氨酸、 苯丙氨酸、葡萄糖酸、淀粉酶、酒精、甘油、十二碳二元酸、十五碳二元酸、苏云金杆 菌粉剂、鸟苷、谷胱甘肽、赤藓糖醇、D-核糖，1， 3-丙二醇等生物工程产品的生产效率。 在不偏离本发明的精神和范围的情况下，本领域的普通技术人员可以在形式和细节 上对其做出各种改变和改进，这些均在本发明的保护范围之内，如利用根据密码子简并 原则或碱基互补原则所获得的与本发明的聚羟基脂肪酸酯合成途径的相关基因功能基本 相同的核酸分子，对于聚羟基脂肪酸酯合成途径的相关酶，在其不起主要作用的位点进 行氨基酸插入和/或缺失和/或替换所得到的功能基本相同的蛋白质或多肽的编码基因， 来实现本发明的目的，均被认为落入了本发明的保护范围。
具体实施例方式
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。 下述实施例中的百分含量如无特别说明，均为质量百分含量。
本发明中所使用的术语"PHA"是指由微生物合成的聚羟基脂肪酸酯，其结构通式如 式(I)所示，包括的PHA分子式例如聚羟基丁酸(PHB) 、 3—羟基丁酸和3—径基戊酸的 共聚物PHBV、3 —羟基丁酸和3—羟基己酸的共聚物PHB冊x以及中长链单体如3—羟基己 酸HHx到3—羟基十二酸3-HDD的单聚物或共聚物，。
本发明中所使用的术语"PHA合成途径的相关基因"是指，在PHA合成途径中，参 与了 PHA整个合成过程的各种相关合成酶和调控蛋白所对应的基因；例如PHA合酶基因 phaC， 3—羟酰基一酰基转移蛋白辅酶A转运酶基因phaG， (R)—烯酰基一水合酶基因 phaj基因等。
本发明中所使用的术语"抗逆性"是指微生物在偏离其最佳生长条件下的环境中的 生存能力，比如较高或较低的温度，较高或较低的pH，较高或较低的渗透压，较高的反 馈抑制，有毒物质的存在等。
本发明中所使用的术语"微生物"包括细菌、古细菌、真菌(例如酵母)等。 本发明中所使用的术语"发酵产物"是指一切通过微生物发酵或转化而得到的产品， 比如有机酸、酒精、其他醇类、抗生素、氨基酸、维生素等。
实施例l、在兽疫链球菌中表达/fei/z^rsia e"tr印力a的p/^C^基因影响乳酸及透 明质酸产量菌种兽疫链球菌(5Yre;^ococc〃s zooepiofe/w'c〃s ) ATCC 39920
1) 在标准的聚合酶链式反应条件下，以pBHR68质粒(Spiekermann P， Rehm BHA,Kalscheuer R， Baumeister D， Steinbllchel A. A sensitive, viable-colony stainingmethod using Nile red for direct screening of bacteria that accumulatepolyhydroxyalkanoic acids and other storage compounds. Arch Microbiol 1999，171:73-80)为模板，用引物ATAAAGCTT(HindIII)AAGGAGGATGGCGACCGGCAAAGGC禾口GTTATCGAT(ClaI)CGGCAGGTCAGCCCATAT扩增出/j/ 力a5基因，然后经过HindIII和Clal酶切处理后，插入到质粒pEU308 (Eichenbaum Z. and Federle MJ. Use of the lactococcalnisA promoter to regulate gene expression in Gram-positive bacteria:comparisonof induction level and promoter strength. AppL Environ. Microbiol. 1998， 64:2763-2769)的Spac启动子下限制性内切酶HindIII和Clal的识别位点间，获得质粒pEUHB。然后通过Sphl酶切将质粒上的Lacl基因切除，使/ / M^9基因的表达不需要IPTG诱导，得到质粒pEUHBNOI。
2) 制备兽疫链球菌的感受态细胞，并将质粒pEUHBNOI用电转化方法转入兽疫链球菌中。
感受态细胞的制备
将兽疫链球菌(5Yre/ tococc〃s zooeA Ve啦'c"s ) ATCC 39920在含有THYB (Todd-Hewitt broth)(从0X0ID购买)36. 4 g/L和酵母浸出物0. 5%的培养基中培养12h;然后将其接种到50 mL新鲜的THYB培养基中，接种后D530不超过0. 05，培养到OD530=0. 25即可；并在培养结束前半小时加入透明质酸酶0. 4 mg/mL;
4°C， 8000 g,离心10分钟，弃上清，用20 mL 0. 5 mmol/L蔗糖溶液重悬细胞；
4°C,8000 g,离心10分钟，弃上清，用l mL 0.5 mmol/L蔗糖溶液重悬细胞，再离心，弃上清；将细胞重悬在250uL含有10%甘油的0.5 mmol/L蔗糖溶液中，按使用体积分装到Eppendorf管中；迅速置于-80'C保存。
兽疫链球菌的电转化
在200 u L感受态细胞中加入500-5000 ng质粒pEUHBNOI，冰浴10分钟；将混合体系转移到2 mm电激杯中电激，电压设为2. 5 kv;
用lmL冰冷的THYB将混合体系转移到10 mLTHYB中，冰浴30—60分钟；然后37°C静置培养1小时；接着在14°C， 6000 g，离心10分钟，菌体用1 mL THYB重悬并涂于抗性平板上进行转化子的筛选，得到重组兽疫链球菌(含有pEU朋NOI的兽疫链球菌(5Yre/7tococc"51加o印j'c/e/w'ci;51 ) ATCC 39920)。
3) 重组兽疫链球菌的发酵
种子培养基成分为蔗糖20 g/L，酵母粉10 g/L，牛肉膏10 g/L， MgS04 7H20:2g/L， MnS04'4H20: 0. 1 g/L， KH2P04: 2 g/L,微量元素液lmL/l，种子缓冲液40mL/l。发酵培养基成分为酵母粉20g/L， Na2HP04' 12H20: 6. 2 g/L， MgS04 7H20: 2 g/L， K2S04: 1.3g/L， FeS04.7H20: 5 mg/L，微量元素液2.5mL/l，蔗糖70 g/L。其中微量元素 液含CaCl" 2 g/L， MnS04 4H20 : 24 mg/L， ZnCl2: 46 rag/L， CuS04 5H20: 19 mg/L;种 子缓冲液含Na2,4 12H20 : 36. 76 g/L， NaH2P04 12H20: 15. 98 g/L， NaHCO" 12. 5 g/L。 用接种环分别挑取平板上的兽疫链球菌(5Yre/ tococciAszooeA 'ofe肌'c^ )ATCC 39920 和重组菌菌种，分别接入装有150 mL种子培养基的500 mL三角瓶中，于200 rpm的摇 床上培养14一16小时，培养温度设为37'C;然后按10% (体积比)的接种量将种子接 入发酵罐(7.5升发酵罐(NBS Bioflo 3000， NJ, USA)中装液量3升)中。发酵罐控制温 度37'C， pH值7.0，通气量5L/min。初始搅拌速度200 rpm，当溶氧降到0时升高转速 到500 rpm，溶氧再次降到0时转速调为650 rpm，并维持到发酵结束，兽疫链球菌 (5Yr印tococciAS zoo印iofe肌'c"s ) ATCC 39920发酵14小时，重组菌发酵16小时。分 别测定发酵培养基中的透明质酸和乳酸的含量。结果表明兽疫链球菌(5Yr印tococc^ zooepjVe/w'c"s ) ATCC 39920发酵14小时的透明质酸(Hyaluronic acid, HA)和乳酸产 量分别为5. 4g/L和65 g/L。重组菌发酵14小时的透明质酸和乳酸产量为5. 6g/L和 38g/L，乳酸产量下降42 %; 16小时的产量为7.3 g/L和41 g/L，透明质酸产量上升 34 %，乳酸产量下降37 %。乳酸合成是兽疫链球菌在缺氧条件下主要的获取细胞内氧 化力(NAD)的途径，因此细菌在发酵过程中产生大量的乳酸。而引入PHB合成途径为细 胞提供了一条外源的NAD再生途径，从而可以降低乳酸途径的压力，使乳酸合成大大减 少，乳酸的大量减少，使更多的的碳源能够流向别的代谢途径，从而使透明质酸产量也 得到一定提高。
其中，透明质酸含量测定采用Bitter-Muir氏法(Bitter T. ， Muri HM. A modified uronic acid carbazol reaction. Anal. Biochem. 1962,4:330-334)，发酵液的测量 样品制备方法如下a)取1 mL发酵液准确稀释到4 mL， 6000转离心10分钟；b)取1 mL 上清加入到4 mL无水乙醇中，振荡，6000转离心5分钟；c )弃去上清，加入2 mL 0. 2mraol/L NaCl，放置，间或振荡，直至最终溶解；d)加入4 mL无水乙醇，振荡，6000转离心5 分钟；e)弃去上清，沉淀用2mL去离子水溶解作为HA测定的样品。乳酸盐浓度的测定 采用HPLC (SpectroSYSTEMP2000, Thermo Separation Products, USA)法。折光检测器， 离子交换柱Aminex HPX-87H， 300mmX7. 8mm，流动相为0. 005咖ol/L硫酸溶液，流速0. 50 mL/min。检测前，取0. 2 mL发酵样品，准确稀释到4 mL， 10000 rpm/min离心5分钟， 去上清，0.45ym滤膜过滤后作为色谱的样品。
实施例2、在光滑球拟酵母中表达p力6C^基因影响丙酮酸产量
菌种光滑球拟酵母(7ori/7opsis ^a6rate) CCTCCM202019
培养基斜面和种子培养基(U:葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L， KH2P04 1 g/L， MgS04 7H20 0. 15 g/L，琼脂20 g/L(斜面用),pH 5. 5。发酵培养基葡萄糖80 g/L，蛋白胨15 g/L(含氮量12%),KH2P04 5 g/L， KC1 5g/L， MgS04 7H20 0.18 g/L，烟酸4mg/L,盐酸硫胺素20 U g/L,盐酸吡哆醇100ug/L，生物素10lig /L，核黄素50 ug/L,pH5.0。
将质粒pB服68用BamHI和EcoRI酶切处理后，将获得的5. 2kb的片段插入到质粒pPIC9K(购于Invitrogen公司)的BamHI和EcoRI的识别位点间，获得质粒pPICHB。这个质粒以电转化的方法转入到光滑球拟酵母(7br^o/^^^s6rafa) CCTCCM202019中获得重组菌(含有pPICHB的光滑球拟酵母(7b/7/"/^A《7a力r3ta) CCTCCM202019)进行发酵实验。
分别取斜面培养的光滑球拟酵母(7bi^7opw's ^a力/^te) CCTCCM202019和重组菌分别接种到种子培养基(50 mL/500 mL锥形瓶)，在3(TC、 200 rpm下培养12小时后，以10 M(v/v)接种量接入发酵培养基。7. 5 L发酵罐装液量3 L ,温度3(TC，通气量2 L/min ，搅拌转速700 rpm ,用5 mol/L KOH控制pH为5. 0。当残糖降至4%时，按一定速率流加400 g/L的葡萄糖液进行流加培养，发酵时间48小时。
取2 mL发酵液在8000 g离心5分钟后，上清用乳酸脱氢酶法测定丙酮酸含量(La即erecht W, Heinz F. In: Methods of enzymatic analysis, ed. Bergmeyer, H. U. VCH，Weinheim， 1984,6: pp570-577)。细胞用去离子水洗两次后真空冰干。结果表明重组菌的丙酮酸产量为68 g/L，比光滑球拟酵母(7b77y7叩sis ^s力r3ts) CCTCCM202019的52g/L提高了约31 %。糖酵解产生丙酮酸的途径是消耗NAD的，丙酮酸在细胞内被代谢掉则是合成NAD的过程。因此细胞内大量积累丙酮酸需要一个高氧化力的环境。/^力"5基因的引入，能够为细胞提供氧化力，从而提高了丙酮酸的产量。
实施例3、在酿酒酵母中表达p力6C^基因影响麦角固醇产量
菌种酿酒酵母(&cc/ aro/z ycescerew'w'ae) IFFI 01338 (中国科学院微生物所菌种中心保藏号)
斜面，种子培养基以及发酵培养基为葡萄糖40g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉10 g/L，琼脂20 g/L(斜面用)，pH 5.5。
将按照实施例2方法获得的质粒pPICHB以乙酸锂转化的方法转入到酿酒酵母(5"acc力ar咖/ces cereKZ'w'ae) IFFI 01338中获得重组菌(含有pPICHB的酿酒酵母(5"acc力aro/nyces cerew'siae) IFFI 01338)进行发酵实验。
分别取培养在新鲜斜面上的酿酒酵母(5"acc/ aro/z^ces coreKiw'ae) IFFI 01338和重组菌分别接种到种子培养基(50 mL/500 mL锥形瓶)，在30。C、 200 rpm下培养12小时后，以10 W(v/v)接种量接入发酵培养基。7. 5 L发酵罐装液量3 L,温度30°C,通气量2 L/min，溶氧自动控制在15 %，控制pH为5. 5。发酵10小时后每隔6小时补料一次，加入40 g葡萄糖，重组菌培养基中加入遗传霉素0. 2 g/L。发酵30小时后，终止发酵。麦角固醇含量的测定参照文献(许旭萍，李惠珍，佘晨兴，谢华玲，林志军。麦角固醇产生菌7b/7;77oAsA /a/B"a优化发酵条件的研究。生物学杂志，2002， 19: 15-17)。
测定结果表明重组菌的麦角固醇含量为1.2 %，比酿酒酵母(&cc/ aro/^ces cerew'w'ae) IFFI 01338的0. 9 %提高了 33 %。有研究表明，麦角固醇的合成具有氧 代谢的特征，有氧条件有利于其合成。因此，A^C^基因的引入，为细胞提供了更多的 氧化力，从而促进了细胞内麦角固醇的合成。
实施例4、在酿酒酵母中表达p力力C^基因提高酵母菌的抗逆能力 菌种酿酒酵母(5"acc/ aro历/ces cerew'w'ae) ACCC 2063 将按照实施例2方法获得的质粒pPICHB以乙酸锂转化的方法转入到酿酒酵母 (5^cc/ aro/nyces cereWsj'ae) ACCC 2063中获得重组菌(含有pPICHB的酿酒酵母 (5"acc力ara/z yces cerei^9i'ae) ACCC 2063)进行发酵实验。
分别取培养在新鲜斜面上的酿酒酵母(5^cc力a/YMiKces cerew'siae) ACCC 2063和 重组菌分别接种到种子培养基(50 mL/500 mL锥形瓶)，在3(TC、 200 rpm下培养12小时 后，以l(P/。(v/v)接种量接入新培养基。培养基成分为葡萄糖40g/L，蛋白胨20g/L,酵 母粉10g/L，琼脂20g/L(斜面用)，pH5. 5。酿酒酵母(5"acc/ aro/7^cescerew'w'ae) ACCC 2063和重组菌的种子在接入新培养基之前，各分为三组， 一组在48。C放置1小时， 一组 在-8(TC放置48小时，另一组不做处理。然后将种子分别接入新培养基后，测定其生长 曲线。计算未经处理的种子与经过处理的种子延滞期时间之差。结果表明重组菌的种子 经过冷或热处理后，其活性并未受到大幅降低，即延滞期时间与未经处理的种子相差不 大。而酿酒酵母(5acc/ arayz^ces cerew'w'朋)ACCC 2063的种子活性经过冷或热处理 后受到较大的影响。经过热处理后，酿酒酵母(5"acc力3r咖/cescereWw'ae) ACCC 2063 的时间差为7小时，重组菌时间差为l小时，两个相差6小时。即是说积累PHA的细胞 具有更好的恶劣环境耐受性，具有更强的生命力。这对于酿酒工业有重要的意义，由于 发酵过程中酵母死亡会影响发酵，同时带来不适的口味，因此强壮的菌株有着更好的应 用前景。
实施例5、在枯草芽孢杆菌中表达p力力C^影响肌苷的生物合成 菌种枯草芽孢杆菌(&ci77"s s"6"7A ) ATCC 19162。
种子培养基成分为葡萄糖20 g/L，酵母粉15 g/L，蛋白胨10 g/L，玉米液7 g/L， 氯化钠2.5g/L，尿素2g/L， pH值7.0。发酵培养基成分为葡萄糖140 g/L,玉米液16 g/L，酵母粉16g/L，尿素9g/L,硫酸铵16g/L，七水硫酸镁4 g/L，磷酸氢二钾5 g/L， 碳酸钙20 g/L。
按照实施例1方法获得的质粒pEUHB以电转化的方法转入到枯草芽孢杆菌(^w'W^ w6fWis ) ATCC 19162中获得重组菌(含有pEUHB的枯草芽孢杆菌(SacWhs仰Z^/7A ) ATCC 19162)进行发酵实验。
分别取培养在新鲜斜面上的枯草芽孢杆菌(泡w77"s sM07is ) ATCC 19162和重组菌分别接种到种子培养基(50 mL/500 mL锥形瓶)，在32°C、 200 rpm下培养12小时后，以5呢(v/v)接种量接入发酵培养基。7. 5 L发酵罐装液量3 L，自动控制温度35°C， pH 6. 5，搅拌速度600 rpm，通气量1 L/min,到肌苷产量不再增加停止发酵，发酵时间68小时。肌苷含量用HPLC测定，流动相为0. 5 %磷酸氢二钾，流速1. 2 mL/min,色谱柱为HypersilODS C18反相柱，检测波长为254 nm。 HPLC测定结果表明枯草芽孢杆菌(fe^77"ss"Z^7A ) ATCC 19162的苷产量为19 g/L，重组菌的产量为24 g/L，提高了 26 %。在细胞内代谢途径中，为肌苷合成提供前体的单磷酸己糖途径会消耗大量的NADP,同时从6-磷酸葡萄糖到磷酸戊糖途径的调控酶6-磷酸葡萄糖脱氢酶受到NADPH的反馈抑制，因此NADPH的减少能促进葡萄糖向磷酸戊糖途径的转化。总的来说，肌苷合成是一个需要大量氧化力的生化代谢过程，高的NADP/NADPH水平能够有效的促进肌苷的合成。p力力C^基因的引入，正能实现这一要求，因此能够显著的提高肌苷的产量。
实施例6、在嗜碱芽孢杆菌中表达/^力C^基因影响弹性蛋白酶产量
菌种嗜碱芽孢杆菌(5acj77"sa7ca7o; /l 7iAS) Ya-B (Takagi H， Tsai YC, NakamoriS， Yamasaki M. Improved Production and Recovery of Alkaline Elastase fromAlkalophilic Bacillus Strains by a Change of Medium Composition, ^5/osc/ 5i"ec/ A'oc力e/z , 1995， 59:1591-1592)
种子培养基成分为葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母粉5g/L，磷酸氢二钾lg/L，七水硫酸镁0. 2 g/L，氯化钠5 g/L，碳酸钠10 g/L。发酵培养基成分为葡萄糖20 g/L，豆饼粉5 g/L，酵母粉2. 5 g/L，磷酸氢二钾0. 75 g/L，七水硫酸镁0. 2 g/L，氯化钠20 g/L，碳酸钠10 g/L。
将实施例1中获得的pEUHB以电转化的方法转入到嗜碱芽孢杆菌(5s"77ma7ca7op/ /7"s)Ya-B中获得重组菌(含有pEUHB的嗜碱芽孢杆菌(ifeci"m a7caJQ。力j7"s)Ya-B)进行发酵实验。获得重组菌进行发酵实验。
分别取培养在新鲜斜面上的嗜碱芽孢杆菌嗜碱芽孢杆菌(^sw7J"s a化a7o/ 力i7^)Ya-B和重组菌分别接种到种子培养基(50 mL/500 mL锥形瓶)，在37。C、 250 rpm下培养12小时后，以l M(v/v)接种量接入发酵培养基(50 mL/500 mL锥形瓶)，37°C， 250 rpm培养48小时，停止发酵。将发酵液8000 g离心十分钟，收集上清，用硫酸铵分级盐析(30%-65%饱和度)，沉淀溶于0.05 mo1/1 pH 9.0硼酸缓冲液中，得到粗酶液。1 mL粗酶液中与20 mg地衣红-弹性蛋白中分别加入1 mL 0.05 mol/L pH 9. 0硼酸缓冲液于55'C水浴保温一小时，不时振荡。分别以2 mL 0.7 raol/L p服.0磷酸缓冲液终止反应，8000 g离心10分钟，上清于590 nm测吸光度值。20 mg地衣红-弹性蛋白完全水解后，590 nm处光吸收值的一半为10个酶活力单位。
经过48小时发酵培养后，重组菌的酶活198 U/mL比嗜碱芽孢杆菌(Aa^77〃sWca7叩/Lz7M) 176U/mLYa-B高12.5%，重组菌具有更高的弹性蛋白酶产量。研究表明，高溶氧有利于弹性蛋白酶的合成，其合成是一个需要氧化力的过程。/^AC^基因的引入， 正好能够为细胞提供更多的氧化力，这是有利于弹性蛋白酶的合成的。 实施例7、在红酵母中表达p力力"5基因影响类胡萝卜素产量
菌种红酵母(^ o^tor"^《7"";7&) NCIM 3353 (印度国家工业微生物菌种保 存中心)
斜面培养基成分为葡萄糖35 g/L，麦芽提取物3 g/L，酵母粉2 g/L， KH2P04 3 g/L， K2HP04 3 g/L， MgS04.7H20 0.2 g/L，琼脂20 g/L， pH 6.0。
液体培养基为葡萄糖25g/L，酵母粉10g/L， KH2P042g/L， K2HP04 2 g/L， pH6.0。 将实施例2中获得的pPICHB以乙酸锂转化的方法转入到红酵母(^70flbto/Y/h 《7"i/7J's) NCIM 3353中获得重组菌(含有pPICHB的红酵母(朋oo^or"7a ^7""/ is) NCIM 3353)进行发酵实验。
分别取培养在新鲜斜面上的红酵母(A%oobto/7y7a ^""/7i's) NCIM 3353和重组菌 分别接种到种子培养基(50 mL/500 mL锥形瓶)，在28°C、 240 rpm下培养18小时后，以5 免(v/v)接种量接入新鲜液体培养基(100 mL/500 mL锥形瓶)，28°C， 240 rpm培养72小 时。发酵液3000 rpm离心十分钟收集菌体，用去离子水洗两次后冰干称重。每克菌体加 5 mL 3 mol/L HC1，室温下浸泡1小时，在沸水浴中煮4分钟，迅速冷却，3000 g离心 十五分钟，弃去上清，沉淀用去离子水洗两次后加3mL丙酮，室温下振荡三十分钟，再 3000 g离心二十分钟，上清即为类胡萝卜素提取液，将提取液稀释后，测475 nm处吸光 度值，按下式计算胡萝卜素含量胡萝卜素含量(Ug/g菌体^A475 XVXD/0. 16w。 A475 为胡萝卜素吸光度值，V为提取所用溶剂量(mL) ， D为样品稀释倍数，w为菌体量(g) ， 0. 16 为胡萝卜素的摩尔消光系数。
结果表明红酵母(朋W"ort/7agA/"/7^) NCIM3353的类胡萝卜素含量为76u g/g， 而重组菌的含量为92u g/g，提高了 21 %。高氧化力环境有利于类胡萝卜素的合成。p力6C^ 基因的导入，能够为细胞提供氧化力，从而促进类胡萝卜素的合成。 实施例8、在谷氨酸棒杆菌种表达p力6^l應响谷氨酰胺合成 菌种谷氨酸棒杆菌(Co/y/ eZ acte/"y〃/Z7 g7"te/w'c"/z ) ATCC 13032。 种子培养基及发酵成分为 一水葡萄糖50 g/L, (NH4)2S04 7 . 5 g/L， NaCl 2 g/L, CH3C00Na 2H20 3 g/L, CaCl2 2H20 0. 1 g/L， K2HP04 3H20 8 g/L， KH2P04 2g/L,尿素5 g/L，MgS04 7H20 0 . 5 g/L，盐溶液10 mL/l，生物素6u g/L,维生素B1 1 mg/L，卡那霉素 20 mg/L。其中盐溶液为MnS04 7H20 20 mg， Na2B407 跳0 2 mg, (NH4)5M07024 4H20 1 mg， FeCl2 6H20 20 mg， ZnS04 7H20 5 mg， CuS04 5H20 2 mg， FeS04 7H20 250 mg,溶于50 mL 1 mol/L HCl中。
将实施例l中获得的质粒pEUHB以电转化的方法转入到谷氨酸棒杆菌 (Corj77eZ acten》7/ ^7"a/7W'c"历)ATCC 13032中获得重组菌(含有pEUHB的谷氨酸棒杆菌(Corj77e6acz^rj'"历《7"ta肌'c鹏)ATCC 13032)进行发酵实验。
分别取培养在新鲜斜面上的谷氨酸棒杆菌(Coo77e^cteri鹏^"a肌'c鹏)ATCC13032和重组菌，分别接种到种子培养基(50 mL/500 mL锥形瓶)，在30。C、 200 rpm下培养12小时后，以5 %"八)接种量接入发酵培养基。7.5 L发酵罐装液量3 L,自动控制温度3CTC， pH 6.5,搅拌速度600 rpm，通气量l L/min,发酵48小时，停止发酵，测定发酵液中谷氨酰胺含量。谷氨酰胺的测定用新华3号滤纸在室温下用不饱和法展开，展开剂用体积比为5: 2的正丙醇和浓氨水的混合液，上行法展开。称取谷氨酰胺标准品，配成1%，1.5%， 2%， 2.5%， 3%等不同质量浓度的溶液，每种溶液点样luL，发酵液离心取上清点样lyL。展析完成后风干滤纸，用0.5g/L茚三酮丙酮溶液显色，105。C烘干5分钟，滤纸上出现紫红色氨基酸斑点，剪下氨基酸斑点，用洗脱液(体积比为2:38的0. lg/L CuS04 5H20和75%乙醇的混合液)洗脱30分钟，然后在520 nm处测光吸收，从标准曲线上求得发酵液中谷氨酰胺含量。结果表明谷氨酸棒杆菌(6b/y/7e力a"e/7'湖^W柳ic湖)ATCC 13032的谷氨酰胺产量为ll g/L,重组菌产量为14 g/L，提高约27 %。 p力M^感因的引入，能够减少丙酮酸向乳酸的代谢，促进丙酮酸转化为乙酰辅酶A，而谷氨酰胺的前体正是三羧酸循环的中间产物，这样能够为谷氨酰胺的合成提供更多的前体，因此产量得到提高。实施例9、在乳酸发酵短杆菌中表达p力力6M應响赖氨酸产量菌种乳酸发酵短杆菌(^rew'力a"6^'〃历7acZ^/"er/z7e/7Z^z ) ATCC 31269。斜面培养基成分为牛肉膏0.3%，蛋白胨1 %，NaC10.5 %，琼脂2 %， pH 7. 2-7. 4。种子培养基成分为葡萄糖2 %， KH2P04 0.1 %， (NH4)2S04 1 %， MgS04 7H20 0. 04%， FeS04*7H20 1 mg/L， MnS04 H20 0. 8 mg/L，生物素5 ix g/L， VB1 20 mg/L，豆饼水解液5 %， pH 7. 0。
发酵培养基成分为葡萄糖14%, KH2P04 0.1 %， (NH4)2S04 4 %, MgS04 7H20 0. 04%， FeS04.7H20 1 mg/L， MnS04 H20 0. 8 mg/L，生物素5ug/L，维生素Bl 20 mg/L，豆饼水解液5 %，碳酸钙2 %， pH 7.0。
将实施例l中获得的质粒pEUHB以电转化的方法转入到乳酸发酵短杆菌(5rew7 acte/7'鹏7actofei7Z7e/7t"历)ATCC 31269中获得重组菌(含有pEUHB的乳酸发酵短杆菌(i5re"A3"eri〃忍^3"o/"e/^67 z^7 ) ATCC 31269)进行发酵实验。
分别取培养在新鲜斜面上的乳酸发酵短杆菌(5rew'力acteri咖7a"ofe/y/7e/7t"历)ATCC 31269和重组菌，接种于一级种子培养基中，500 mL摇瓶装液量30 mL，于摇床上30'C， 110 rpm，培养12小时。接种2 mL—级种子于30 mL二级种子培养基中，于摇床上30°C， 110 rpm，培养IO-12小时。然后取l mL二级种子接种于发酵培养基，500 mL摇瓶装液量20 mL， 3CTC， 110 rpm，培养72小时。赖氨酸含量用茚三酮比色法测量发酵液经3500 g离心15分钟，取上清O. 1 mL稀释到100 mL，取l mL稀释液加入到4 mL茚三酮试剂(取水合茚三酮l.O g，加入乙二醇甲醚75 mL，另取1.34 g CuCl2 2H20加入pH1. 3拧檬酸缓冲液25 mL中，混合两种溶液后，再加蒸馏水IOO mL，得到茚三酮溶液)中，沸水浴加热 20分钟，快速冷却后测定478 nm处吸光度值。根据标准曲线测定赖氨酸含量。
结果表明乳酸发酵短杆菌(5rew77a"e/^鹏7acto/"erme/ t"历)ATCC 31269赖氨酸 产量为53g/L，而重组菌的产量为58 g/L，约有IO %的提高。在合成代谢中，赖氨酸的 前体物质草酰乙酸有三条途径合成，但都与丙酮酸和NADP/NADPH的代谢有关，因此p力/^/^ 基因的导入能对赖氨酸的产量产生影响。
实施例10、在大肠杆菌中表达/ /^C^基因影响苯丙氨酸产量
菌种大肠杆菌(^sc/ aric力ia. co力')ATCC 31882。
种子培养基成分为蛋白胨1 %，酵母粉0.5 %， NaCl 1 %，葡萄糖2 %， pH7.5。
发酵培养基成分为Na2HP04 12H20 : 20 g/L，柠檬酸钠6 g/L，谷氨酸钠0. 4 g/L， 酪氨酸0. 6 g/L，葡萄糖20 g/L。
补料培养基:CaCl2 2H20 0. 6 g/L，酪氨酸500mg/L，葡萄糖500g/L， MgS04 7H20 1 g/L，维生素Bl 500 mg/L，氨水28 %。
将pBHR68质粒以电转化的方法转入到大肠杆菌(&c力erj'c力J'a coh') ATCC 31882中 获得重组菌(含有pBHR68的大肠杆菌(^sc力eric力ia. ATCC 31882)进行发酵实验。
分别取培养在新鲜斜面上的大肠杆菌(v&c力en'c/w'a. co7i) ATCC 31882和重组菌， 分别接种到种子培养基(50 mL/500 mL锥形瓶)，在37。C、 200rpm下培养12小时后，以5 y。(v/v)接种量接入发酵培养基。7.5 L发酵罐装液量3 L，自动控制温度38.5T:， pH 7.0， 溶氧20 %，通过补料控制葡萄糖浓度在1.5 %，发酵时间48小时。苯丙氨酸含量测定方 法如下取2uL发酵液上清点样于滤纸上，置于层析液中单向上行展析16小时，烘干后 以茚三酮喷涂显色，以标准氨基酸为对照，剪下层析后的着色斑点，置于65%的乙醇溶 液中脱色2小时，测定520 nm下光吸收，氨基酸量-标准氨基酸溶液浓度X被测发酵液光 密度/标准氨基酸溶液光密度。
结果表明大肠杆菌(fsc力en'c/^a co7j') ATCC 31882发酵得到苯丙氨酸浓度为8. 2 g/L，而重组菌产物浓度为10.6 g/L，提高了29 %。对于大肠杆菌的氨基酸合成，如果 用全局的代谢调控能够取得较好的效果。而p/^"，因的引入， 一个有效的调控是能增 强磷酸戊糖途径，有利于氨基酸的合成。
实施例11、在荧光假单胞菌中表达/^MM堪因影响葡萄糖酸产量
菌种- 荧光假单胞菌(/^eiycbyz7。/73s /7〃oresce"s) AS 1.55
斜面培养基成分为牛肉膏0.5 %，蛋白胨1 %， NaC10.5 %，琼脂2 %， pH7. 0。 种子培养基成分为葡萄糖2 %，玉米浆1 %，尿素0.2 %， KH2P04 0.2 %， MgS04 7H20 0. 05 %， pH7. 0。
发酵培养基成分为淀粉水解糖14%，玉米浆1.5%，轻质碳酸钙4%, pH6.7。 将质粒pBHR68经过HindlII和BamHI酶切处理后，插入到质粒pBBRlMCS2 (KovachME，Elzer PH, Hill DS, Robertson GT，Farris MA， Roop RM， Peterson KM. Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBRlMCS， carrying different antibiotic-resistance cassettes. Gene. 1995,166:175-176)的HindIII和BamHI的识 别位点间，获得质粒pBBRHB。这个质粒以电转化的方法转入到荧光假单胞菌(Fw"必历朋as /7i;aresce/7s) AS 1. 55中获得重组菌(含有pBBRHB的荧光假单胞菌(/^ed/ob/z 朋as /7〃oresce/^) AS 1.55)进行发酵实验。
分别取培养在新鲜斜面上的荧光假单胞菌(/^ew/o卿朋s /7"oresce/^) AS 1. 55和 重组菌分别接种到种子培养基(50 mL/500 mL锥形瓶)，在3(TC、 230 rpm下培养16小时 后，以10。"v/v)接种量接入发酵培养基。发酵瓶500mL装液量50mL，在30'C、 230 rpm下 培养72小时。发酵液中酮基葡萄糖酸含量用旋光法测定发酵液中酮基葡萄糖酸含量= 25'C下发酵液旋光度绝对值/0. 88。
荧光假单胞菌(/^e"0b忍o"ss/7"o/^sce/7s) K1005的发酵液中酮基葡萄糖酸含量为 13.4g/L，重组菌的产量为16 g/L，提高了大约19 %， pM"堪因的导入，有利于提高 菌的的耐受力，生长得更好，从而得到更高的转化率。
实施例12、在枯草芽孢杆菌中表达; /7力"堪因影响a-淀粉酶合成
菌种枯草芽孢杆菌(5aci77〃s s""/7A ) ATCC 21556。
种子培养基成分为(300 mL):葡萄糖1 g，牛肉膏1 g，蛋白胨1 g， NaCl 1 g， KH2P04 1 g，淀粉1 g， pH 7.0。
发酵培养基成分为(200 mL):牛肉膏lg，蛋白胨lg， NaCllg， KH2P041 g， NaH2P04 1 g，淀粉3 g。
将按照实施例l方法获得的质粒pEUHB乙酸锂转化的方法转入到枯草芽孢杆菌 (few7AAs犯6ti7is) ATCC 21556中获得重组菌(含有pEUHB的枯草芽孢杆菌(fecW"s i"7is ) ATCC 21556)进行发酵实验。
分别取培养在新鲜斜面上的枯草芽孢杆菌(飽"7"s s"&i7is ) ATCC 21556和重 组菌分别接种到种子培养基(50 mL/500 mL锥形瓶)，在32。C、 200rpm下培养12小时后， 以10 W(v/v)接种量接入发酵培养基(50mL/500mL锥形瓶)，32°C， 200 rpm培养72小时， 测定a-淀粉酶酶活力。酶活力测定取5mL发酵液，4000 g离心15分钟，取上清与5-乙 縮醛-麦芽庚糖-对-硝基苯反应，酶活力单位定义为37°C， l分钟分解lumol淀粉为葡 萄糖即为l个酶活单位。
结果表明枯草芽孢杆菌(泡w7A^sMtj7A) ATCC 21556的发酵液中酶活为67 U/L， 而重组菌酶活为76 U/L。重组菌的发酵液中有更高的淀粉酶活力，这可能是因为/^6C^ 基因导致细胞内的代谢途径发生变化，使其倾向于有利于细胞生长的方向，提高了细胞 利用淀粉作为碳源的能力，即是增加了细胞的淀粉酶产率。
实施例13、在酿酒酵母中表达; /^(^，因影响酒精产量菌种酿酒酵母(&cc力ai"o/z /ces cerew'w'ae ) ACCC 2063。
将按照实施例2方法获得的质粒pPICHB以乙酸锂转化的方法转入到酿酒酵母 (6"acc/ ar咖/ces cererisiae ) ACCC 2063中获得重组菌(含有pPICHB的酿酒酵母 (&cc/ a濯yces cere"w'ae ) ACCC 2063)进行发酵实验。
固体培养基配制量取5 Bx麦汁200 mL放入500 mL烧杯中，在沸腾状态下加入4 g琼 脂，不断搅拌直至完全融化，分装于试管中高压灭菌，然后放斜面；液体培养基配制 量取5 Bx麦汁llO mL装入250 mL三角瓶中，调pH4. 8-5. 0，然后高压灭菌；发酵培养基配 制称淀粉300 g倒入1200mL4(TC温水中，搅拌均匀，加入0.2%氯化钙，调节pH6. 0-6. 2， 称取液化酶l g，于9(TC-93"温度下液化30分钟，直至加入碘液不变色，液化结束后将 其迅速冷却到58'C-60'C ，并调pH值为4. 4-4. 6，加入l mL糖化酶(十万单位)进行糖化， 在淀粉水解液的糖度在23 Bx时停止，加入2%的玉米浆，并煮沸1小时，冷却过滤，然后 调pH到4.8-5.0，灭菌待用。发酵时按10% (v/v)的接种量接入到发酵培养基中，3(TC保 温发酵72小时。乙醇浓度用高效液相色谱测量发酵液8000 g离心十分钟，取上清过滤 后作为样品；色谱柱为Beckman公司L2Spherogel配合基交换柱，流动相为98%的浓硫 酸H20(体积比为0.5:1000)，流速l mL/min。
结果表明酿酒酵母(5"accA3r咖/ces carew'w'ae ) ACCC 2063发酵液乙醇浓度为15 % ， 而重组酵母的乙醇浓度为20 %，提高了33%， p/ 6^遮因的引入，不仅可以改变细胞内 的代谢流，而且PHA的合成能够提高重组酵母对高乙醇环境的耐受性，从而提高了乙醇的 产量。
实施例14、在克鲁斯假丝酵母中表达/ /^^應因影响甘油产量 菌种克鲁斯假丝酵母(C朋必ofe Ar"sei' ) ACCC 2196。
斜面培养基成分为葡萄糖50g/L，酵母膏20g/L，碳酸钙5g/L，琼脂20 g/L。 种子培养基成分为葡萄糖200 g/L，尿素2 g/L，玉米浆7 g/L。 发酵培养基成分为葡萄糖200 g/L，尿素2 g/L，玉米浆6 g/L。 将按照实施例2方法获得的质粒pPICHB以乙酸锂转化的方法转入到克鲁斯假丝酵母 A/Yyse2' ) ACCC 2196中获得重组菌(含有pPICHB的克鲁斯假丝酵母(Ca/7力'血 Ar"sei' ) ACCC 2196)进行发酵实验。
分别取培养在新鲜斜面上的克鲁斯假丝酵母(Ca/7力Va A/v^ei ) ACCC 2196和重组 菌分别接种到种子培养基(40 mL/500 mL锥形瓶)，在3(TC、 230 rpm下培养12小时后，以 10y。(v/v)接种量接入发酵培养基，7. 5 L发酵罐装液量3 L，自动控制pH5.5，温度3(TC， 通气量0.5 L/min，搅拌转速450 rpm，残糖接近O时停止发酵，测定发酵液中甘油含量。 发酵液中甘油含量用高效液相色谱检测发酵液8000 g离心十分钟，取上清过滤后作为 样品；色谱柱为Beckman公司L2Spherogel配合基交换柱，流动相为98%的浓硫酸:&0(体 积比为O. 5:1000)，流速l mL/min。结果表明克鲁斯假丝酵母(C朋必A々27;sei ) ACCC 2196最终甘油浓度为62 g/L， 而重组菌为75 g/L，提高了21 %。在发酵过程中，有相当部分的碳源会流向乙醇合成， 这降低了甘油的得率。乙醇途径是为细胞提供氧化力的一条途径,/^力"趣因得引入， 能够降低乙醇途径的压力，促进糖酵解，使更多的碳源流向甘油合成，增加了甘油的得 率。
实施例15、在热带假丝酵母中表达p力6C4感因影响十二碳二元酸的合成 菌种..热带假丝酵母(Cs/7力W3 z^TQW'csJis ) UH22248 (任刚，陈远童，十二碳二 元酸的发酵研究，生物工程学报，2000， 16: 198-202)。 斜面培养基成分为10 Bx的麦芽汁，1.5 %琼脂粉。
种子培养基成分为酵母膏5g，玉米浆3g，蔗糖5g， KH2P04 8 g，加水定容至1L 灭菌，接种时再加入尿素0.3 %，重腊5 %。
发酵培养基为酵母膏2 g，玉米浆1 g，蔗糖2 g， KH2P04 8 g， NaCl 1 g，加水 定容至100mL灭菌，接种时再加正十二烷20 %，尿素0.12 %，重腊3.3 %， pH 7. 3。
将按照实施例2方法获得的质粒pPICHB以乙酸锂转化的方法转入到热带假丝酵母 (Ca/ 力V/a ^roAZ'ca7is ) UH22248中获得重组菌(含有pPICHB的热带假丝酵母(Cs"c/2Wa tro贝'ca7A ) UH22248)进行发酵实验。
将斜面培养48小时的热带假丝酵母(C朋力'c/a tro/^'cs力's ) UH22248和重组菌分别 接种到种子培养基中(100 mL/500 mL摇瓶)，在30。C、 180 rpm下培养48小时后，接种3 mL 到100 mL发酵培养基中，3CTC、 180rpm培养4天，发酵结束。取15ml发酵液，用6 mol/L HCl调pH值到3.0，加入120 mL乙醚，摇动100次，放置30分钟，然后倒出40 mL乙醚提取 液，通风橱中风干得到白色固体，然后将其用95 %的中性热乙醇溶解，加入一滴酚酞， 用标准NaOH溶液滴定，记录所用的NaOH，计算十二碳二元酸产量。
结果表明重组菌(十二碳二元酸产量为92g/L)显示出了比热带假丝酵母(&77Q^fe
^ MicWis) UH22248 (十二碳二元酸产量为78g/L)更高的十二碳二元酸产量，发酵液 比较粘稠，细胞处于一种低溶氧水平的环境，； /^"g因的引入能够在这种条件下为细 胞提供氧化力，同时其可能也对脂肪酸氧化途径有抑制作用，从而增加了发酵液中的二 元酸产量。
实施例16、在热带假丝酵母中表达p力6^盛因影响十五碳二元酸的合成 菌种热带假丝酵母(Ca/7力Va ti^w'ca7A) T25-14 (陈远童，郝秀珍，庞月川，十 五碳二元酸的发酵研究，微生物学报，1995， 35: 433-437)。 斜面培养基成分为10 Bx的麦芽汁，1.5 %琼脂粉。
种子培养基成分为酵母膏5 g/L，玉米浆3 g/L,蔗糖5 g/L， KH2P04 8 g/L配好 灭菌，接种时再加入尿素0.3 %，重腊5 %。
发酵培养基为酵母膏2g/L，玉米浆lg/L，蔗糖lg/L， KH2P04 8 g/L， NaCl lg/L加水定容至IOO mL灭菌，接种时再加正十五烷20 %，尿素0.12 %， pH 7.5。 将按照实施例2方法获得的质粒pPICHB以乙酸锂转化的方法转入到热带假丝酵母 (Ca/K/i^ fro/^ca力's ) 1~25-14中获得重组菌(含有pPICHB的热带假丝酵母(C朋力Va tro^'ca7i's ) T25-14)进行发酵实验。
将斜面培养48小时的热带假丝酵母(Ca"力Va tr0jw'Ca^'s ) TV"和重组菌的种子分 别接种到种子培养基中(50mL/500mL摇瓶)，在3(TC、 220 rpm下培养48小时后，5 % (v/v) 接种量接种到发酵培养基中(50mL/500mL摇瓶)，30°C、 220 rpm培养72小时。取15ml发酵 液，用6 mo1/1 HCl调pH值到3.0，加入120ml乙醚混匀，放置直到分层，除去水层，放出 乙醚提取液，通风橱中风干得到白色固体，然后将其用95 %的中性热乙醇溶解，加入一 滴酚酞，用标准NaOH溶液滴定，记录所用的NaOH，计算二元酸产量。
结果表明热带假丝酵母(Ca/7力Va ^r叩J'c^j's ) T2W4的二元酸产量为36 g/L，重组 菌为43 g/L，提高了19 %。重组菌发酵液比较粘稠，细胞处于一种低溶氧水平的环境， p力6Q感因的引入能够在这种条件下为细胞提供氧化力，同时其可能也对脂肪酸氧化途 径有抑制作用，从而增加了发酵液中的二元酸产量。
实施例17、在苏云金芽孢杆菌中表达; 力力"堪因对芽孢形成的影响 菌种苏云金芽孢杆菌(fec/77"s t/ "nV^ie/ w's ) ACCC 10068。 将按照实施例l方法获得的质粒pEUHB以电转化的方法转入到苏云金芽孢杆菌 (5aw77"s t力"/7'/^ie/ w's ) ACCC 10068中获得重组菌(含有pEUHB的苏云金芽孢杆菌 (&ci^i/s ^ 〃n'/^7'e/ sis ) ACCC 10068)进行发酵实验。
分别取培养在新鲜斜面上的苏云金芽孢杆菌(^3ciW^ t/ "h/^ieT7Si's ) ACCC 10068 和重组菌，分别接种到种子培养基(50 mL/500 mL锥形瓶)，在25'C、 220 rpm下培养12 小时后，以l M(v/v)接种量接入发酵培养基(50 mL/500 mL锥形瓶)，25°C， 220 rpm发酵 36小时。培养基成分均为牛肉膏0.3 %,蛋白胨0.5 %， pH 7.2。发酵后用血球计 数板计量孢子含量。
通过显微镜观测可以看到，重组菌的菌体量(10.2*109个/1111)以及孢子数(1.5*109 个/ml)都高于苏云金芽孢杆菌(5aw77"s ^ "ri/^7'e/wis) ACCC 10068 (菌体量9. 1*109 个/ml,孢子数1.1*109个/!!11)。发酵实验表明高溶氧是有利于孢子形成的。pMC4應因 的引入，能够促进孢子形成。
实施例18、在枯草芽孢杆菌中表达/^力^應响鸟苷合成
菌种枯草芽孢杆菌(5a"7k ) ATCC 19220。
种子培养基成分为葡萄糖20 g/L，酵母粉10 g/L，蛋白胨10 g/L，玉米液10 g/L， 氯化钠5 g/L，尿素2 g/L，味精5 g/L， pH 7.0-7.2。
发酵培养基成分为葡萄糖120g/L，豆饼水解液50g/L，酵母粉16g/L,硫酸铵15 g/L，七水硫酸镁4g/L,磷酸氢二钾2g/L，味精10g/L，碳酸钙2g/L， pH 7. 0-7. 2。将按照实施例l方法获得的质粒pEUHB通过乙酸锂转化的方法转入到枯草芽孢杆菌 (5a^77"ss"力"7j's) ATCC 19220中获得重组菌(含有pEUHB的枯草芽孢杆菌(j acW7"s s〃力^ 7is ) ATCC 19220)进行发酵实验。
分别取培养在新鲜斜面上的枯草芽孢杆菌(泡^72"s s"&i7is ) ATCC 19220和重 组菌分别接种到种子培养基(50 mL/500 mL锥形瓶)，在36'C、 140 rpm下培养10小时后， 以IO y。(v/v)接种量接入发酵培养基(50 mL/500 mL锥形瓶)，36°C、 220 rpm下培养60小 时，测定鸟苷含量。鸟苷含量用HPLC测定，流动相为0.5%磷酸氢二钾，流速1.2mL/min， 色谱柱为Hypersil ODS C18反相柱，检测波长为254 nm。
结果表明枯草芽孢杆菌(iS3c/77i^ ^/力"7is ) ATCC 19220鸟苷产量为16 g/L，重 组菌的产量为20 g/L，提高了25 %。在细胞内代谢途径中，为鸟苷合成提供前体的单磷 酸己糖途径会消耗大量的NADP，高的NADP/NADPH水平能够有效的促进鸟苷的合成。W力C45 基因的引入，正能实现这一要求，因此能够显著的提高鸟苷的产量。
实施例19、在酿酒酵母中表达p力M^，因影响谷胱甘肽产量
菌禾中-酉良酒酵母(5"3cc/ aro/n7ces cereFis/se )KY6186 (Sakato K， TanakaH. Advanced control of glutathione fermentation process. 5iotec力/707历'oe恥1992， 40:904 -912)。
斜面培养基成分为麦芽汁10g/L，酵母粉3g/L，蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L， 琼脂20 g/L， pH 7.0-7.2。
种子培养基成分为葡萄糖30g/L，酵母粉6g/L，磷酸氢二铵3g/L，硫酸镁0.8 g/L，磷酸氢二钾1 g/L，磷酸二氢钾1 g/L， pH 7.0-7.2。
发酵培养基为葡萄糖70g/L，酵母粉15g/L，麦汁60g/L，磷酸氢二铵10 g/L， 硫酸镁5 g/L，蜜糖28 g/L，玉米浆16 g/L，磷酸氢二钾1 g/L，磷酸二氢钾1 g/L， ZnCl210 mg/L， FeCl2 6 mg/L， CuCl2 6 mg/L， MnCl2 6 mg/L， pH 7.0-7.2。
将按照实施例2方法获得的质粒pPICHB以乙酸锂转化转入到酿酒酵母 (5"acc/7aro历/cescere[/iw'3e ) KY6186中获得重组菌(含有的酿酒酵母(5"acc力aro/^ces carew'siae ) KY6186)进行发酵实验。
分别取培养在新鲜斜面上的酿酒酵母(&cc/ aro/^ces cerew'w'ae ) KY6186和重组 菌分别接种到种子培养基(50 mL/500 mL锥形瓶)，在30'C、 180 rpm下培养24小时后，以 10呢(v/v)接种量接入发 培养基，7.5 L发酵罐中装液量3 L发酵，自动控制温度3(TC， pH5.4，通气量2L/min，前两小时转速200 rpm，之后每小时升高IOO rpm，直到600 rpm， 维持到发酵结束，36小时停止发酵。取发酵得到的新鲜酵母用蒸馏水洗三次后，在40 % 的乙醇中，3(TC萃取2小时，3000 g离心，取上清用ALLOXAN法(上海市医药化验所临床 生化检验(上册)，上海，上海科学与技术出版社，1979)测定谷胱甘肽含量。
结果表明酿酒酵母(5"acc/ arOT/cescerew'siae) KY6186发酵液谷胱甘肽浓度为1. 3g/L，而重组菌的谷胱甘肽浓度为1.6 g/L，提高了23 %。研究表明乙醇合成的降低有利
于谷胱甘肽的合成，而乙醇合成是一个消耗还原力，获得氧化力的过程，p力力C4，因的
引入可以抑制乙醇的合成，提高谷胱甘肽产量。
实施例20、在球拟酵母中表达p/^C4感因对赤藓糖醇产量的影响
菌种球拟酵母(7br"Zo;^is sp) B845 (吴燕，杨晓伟，陆茂林，赤藓糖醇产生
菌B845的形态，生理特征，生物技术，2002， 12: 20-21)。
斜面培养基成分为葡萄糖10 %，酵母膏1 %，脲0. 1 %，琼脂2 %， pH7.0-7.2。 种子和发酵培养基为葡萄糖20 %，酵母膏0.5 %，脲0. 1 %， pH 7.0-7.2。 将按照实施例2方法获得的质粒pPICHB以电转化的方法转入到球拟酵母 (7b/77ZoAsis sp ) B845中获得重组菌(含有pPICHB的球拟酵母(7bri^o/ w's sp ) B845)
进行发酵实验。
分别取培养在新鲜斜面上的球拟酵母(7b/7^叩w's sp) B845和重组菌分别接种到 种子培养基(40 mL/500 mL锥形瓶)，在3(TC、 180 rpm下培养3天后，以5义(v/v)接种量 接入发酵培养基中(50 mL/500 mL锥形瓶)，30°C、 180 rpm下培养3天，测定赤藓醇的产 量。赤藓糖醇产量用高碘酸氧化法测量(原野，应向贤，范光先，诸葛健，高碘酸氧化 法直接测定发酵液中赤藓糖醇，无锡轻工大学学报，2000， 19: 72-75)。结果表明球拟 酵母(7b/""^/^A sp) B845的赤藓糖醇产量为50 g/L，重组菌为55 g/L，提高在IO % 左右，作为赤藓糖醇生产菌，需要有良好的耐高渗能力和代谢碳源能力，而p力MM應因 的引入，导致胞内PHA的合成，是有利于提高上述能力的，因此对赤藓糖醇的合成也有一 定的促进作用。
实施例21、在短小芽孢杆菌中表达p/^"織因影响D-核糖产量 菌种短小芽孢杆菌(fecY77"s ;w/w'7i^ ) ATCC 31095。
种子培养基成分为葡萄糖20 g/L，玉米浆26 g/L，磷酸氢二钾0.03 g/L，磷酸 二氢钾0.01 g/L， pH 6.7。
发酵培养基成分为葡萄糖180g/L，玉米浆28g/L，硫酸铵13g/L，硫酸锰0.05 g/L， pH 7. 0。
将按照实施例l方法获得的质粒pEUHB以乙酸锂转化的方法转入到短小芽孢杆菌 (5acj77"sp"则7"s) ATCC 31095中获得重组菌(含有pEU朋的短小芽孢杆菌(5ac^^t/s p〃肌7"s ) ATCC 31095)进行发酵实验。
分别取培养在新鲜斜面上的短小芽孢杆菌(5aw77iA p^7i7"s ) ATCC 31095和重组 菌分别接种到种子培养基(50 mL/500 mL锥形瓶)，在37。C、 180 rpm下培养18-20小时， 以10 X(v/v)的接种量接入到发酵培养基中。7.5 L发酵罐装液量3 L，控制温度37'C， 通气量3 L/min，搅拌速度650 rpm，发酵72小时，测定发酵液中的D-核糖含量。D-核糖 用地衣酚法测量发酵液5000 g离心10分钟，上清用蒸馏水稀释，使核糖量控制在10-90g/3mL范围内；取3 mL稀释液，依次加入O. 1 %氯化铁浓盐酸溶液3 mL， 0.1 %地衣酚乙 醇溶液0.3 mL，摇匀，沸水浴40分钟，自来水冷却后在60分钟内测量670 nm吸光度值， 通过标准曲线计算核糖浓度。结果表明短小芽孢杆菌(》sci"^^/w啦7^ ) ATCC 31095 的核糖浓度为55g/L，而重组菌可以达到72 g/L，上升了31 %。细胞内核糖的合成是通 过磷酸戊糖途径，这个途径消耗大量的细胞内氧化力，而通过增加溶氧满足细胞的代谢 需求会促进孢子的形成，这不利于通过细胞营养生长生产核糖，因此p力力"感因的引入， 能从内源的途径为细胞提供一定的氧化力NADPH，从而有利于核糖的合成。
实施例22、在大肠杆菌中表达p/^C^提高细菌对重金属离子&2+的耐受性
菌种大肠杆菌(^sc/ aric力ia coh' ) JM109。
大肠杆菌(&c力en'c/w'a )JM109的基本培养基为LB培养基(g/100 mL): 蛋
白胨1.0;酵母提取物O. 5 ; NaCl 1.0， pH 7.0。
重组菌的基本培养基为LB培养基中加入氨苄青霉素至终浓度60 wg/mL。 将质粒pBHR68用电转化的方法转入大肠杆菌(^sc力eric^'aco^') JM109获得重组
菌(含有pBHR68的大肠杆菌(￡sc/ aric/^a ) JM109)。野生型￡ coh' JM109作
为对照。
将大肠杆菌(^sc力en'c/ " coh' ) JM109和重组菌分别接入加入了 1 mg/L、 2 mg/L、 3mg/L、 4mg/L、 5 mg/L、 6 mg/L、 8 mg/L或10 mg/L HgCl2的各自的基本培养基中，培 养条件为500 mL三角瓶装液量lOO mL， 37°C， 200 rpm，培养24小时，测定发酵液的 0D6。。。结果表明当Hg"浓度为4 mg/L时，重组菌的生长受到一定抑制，最大OD咖从2. 7降 到了1.9;当Hg2+浓度上升到10mg/L时，菌体生长几乎完全停止。实验还表明对于未经 外源基因转化的原始宿主菌Aco7yjM109，在Hg"浓度为2mg/L时就完全不能生长。PHB 基因的转入使细菌对汞的耐受力得到了增强。
在相同操作条件下两种菌体从2.5 mg/L Hg2+浓度的模拟废水中富集汞离子，重组菌 的最终富集量为5. 1 mg/g细胞干重，而原始￡ co7/ JM109则仅为1. 7 mg/g细胞干重。 其中，细胞干重用冰干法测量。
实验表明加入PHB合成基因的重组菌与大肠杆菌(￡sc/ eric/w'3 ) JM109相比对 于Hg2+的耐受程度有了较大的提高，在相同的条件下能够更好的在含有重金属离子的培养 基中生长。
实施例23、移动单胞菌中表达p/^C^提高细菌的对高酒精环境耐受性
菌种移动假单胞菌(Z/历o/z70朋s历o&7^s ) NRRL B-4286。
将按照实施例11的方法获得的质粒pBBRHB以电转化的方法转入到移动假单胞菌 (Z,o/w /7M ，Z^7is ) NRRL B-4286中获得重组菌(含有pBBR朋的移动假单胞菌 (Z/MMro/7as /z/oZ ih's ) NRRL B-4286)进行发酵实验。
种子培养基组分(g/ U:葡萄糖IOO ，蛋白胨IO ，酵母膏15， pH 6.0。发酵培养基组分(g/ U:葡萄糖150 ，蛋白胨25 ，酵母膏25， pH 4.5或pH6.0。 发酵液中乙醇质量浓度、菌体浓度、还原糖质量浓度的测定参考(Ingram LO, Gomez PF, Lai X， Moniruzzaman M, Wood BE, Yomano LP and York SW. Metabolic engineering of bacteria for ethanol production. Sj.otec力/7oZ 历oe/ 《.1998,58:204—214) 培养条件
冰箱保藏的菌种分别接入种子培养基中，培养12小时后，以10 y。(v/v)的接种量分
别接入发酵培养基中，进行静止厌氧乙醇发酵。
发酵三角瓶250 mL,装液量为100mL，发酵pH 4.5 (重组菌)，温度35。C，发酵 时间48小时。移动假单胞菌(ZjwMw"as历o&7is ) NRRL B-4286的发酵pH 4. 5禾Q 6. 0 作为对照。
实验表明，移动假单胞菌(Zjfflo历o/2as切o^7j's ) NRRL B-4286在pH 4. 5和6. 0的乙 醇产量分别为21.1 g/L和62.5 g/L，重组菌在pH 4. 5的乙醇产量为59. 2 g/L，接近移动 假单胞菌(Z，oMwas卿6j7is ) NRRL B-4286在pH 6. 0时的水平，表明; / 力C4堪因的转 入有效的提高了细菌的耐酸性，进一步优化发酵条件可以在较低的pH下实现乙醇的高效 生产。
实施例24、在移动假单胞菌中表达p/^C^提高细菌对葡萄糖的利用能力
菌种移动假单胞菌(^y/z o/ff朋as /z7o&'7i's ) NRRL B-4286。
将按照实施例11的方法获得的质粒pB服HB以电转化的方法转入到移动假单胞菌 (Z,o啦/ as ，&7& ) NRRL B-4286中获得重组菌(含有pBBRHB的移动假单胞菌 (Z/历o/z o/7as历o&7is ) NRRL B-4286)进行发酵实验。
种子培养基组分(g/ U:蛋白胨10 ,酵母膏15， pH 6.0。
发酵培养基组分(g/ U:蛋白胨25 ，酵母膏25， pH 6.0，葡萄糖。其中，葡萄糖 的浓度分别为120， 150， 160， 180， 210 g/L梯度。
发酵液中乙醇质量浓度、菌体浓度、还原糖质量浓度的测定参考(Ingram L0， Gomez PF, X， Moniruzzaman M， Wood BE, Yomano U3 and York SW. Metabolic engineering of bacteria for ethanol production, ^/otec/ "o7. A'oe"《.1998,58:204 — 214)
培养条件
冰箱保藏的菌种分别接入种子培养基中，培养12小时后，以体积分数10%的接种量 分别接入发酵培养基中，进行静止厌氧乙醇发酵。
发酵三角瓶500mL，装液量为100mL，发酵pH 6. 0 ，温度35。C，发酵时间48 h。 分别在不同浓度的葡萄糖条件下培养移动假单胞菌(Z/zK^^as/^^'^'s ) NRRL B-4286 和重组菌。
实验结果表明，移动假单胞菌Ccwas/Tzo^'l/s) NRRLB-4286在葡萄糖浓度150 g/L时，乙醇的产量达到最大，为65 g/L，而重组菌在葡萄糖浓度增加到210 g/L时乙醇的产量一直是上升趋势，最大为95 g/L。 PHB合成途径的导入使得细菌对于渗透压的抗 性增强，初糖浓度很高时依然保持良好的生长。移动假单胞菌(々朋o/^"as历o^7is ) NRRL B-4286的乙醇发酵过程有着比酵母更高的葡萄糖的利用率，但是当初始的葡萄糖浓 度达到一定程度后，乙醇产量反而下降。当转入PHB的合成基因后，发酵达到乙醇最大产 量的初糖浓度比移动假单胞菌(。7Z7oy770"asM^L^'s ) NRRL B-4286有了一定的提高。表 明/^6^顺转入有利于提高细菌对渗透压抵抗程度。
实施例25、在丁酸梭芽孢杆菌中表达p/^C^提高从甘油发酵制备l， 3-丙二醇 (1， 3-PD0)的生产
菌种丁酸梭芽孢杆菌("ostrz'^/〃历Zw;^ric"历)ATCC 8260。
将按照实施例l方法获得的质粒pEUHB以乙酸锂转化的方法转入到丁酸梭芽孢杆菌 (C7ostn'W咖ZwO^ 'cm 7 ) ATCC 8260中获得重组菌(含有pEUHB的丁酸梭芽孢杆菌 (67ostri力'"历力"y/7'c"历)ATCC 8260)进行发酵实验。
该发酵需厌氧培养，发酵培养基为甘油6%，葡萄糖1%，玉米浆2%， (NH4)2S04 0. 2 %。发酵温度为34。C，初始pH为6. 5 7 。
培养条件
间歇发酵分为两步进行，首先将丁酸梭芽孢杆菌(Gostri力》/z7Z^t/ric^ )ATCC 8260 和重组菌分别接于装液量为100mL的150mL三角瓶中，在厌氧条件下，于36。C，100rpm， 培养15 h ，然后以10 y。(v/v)的接种量接入装液量为200 mL的250 mL三角瓶中，石 蜡液封，于34。C、 150rpm、初始pH6.8进行发酵。定期取样测定甘油残余量和1, 3-PDO 的生成量。
发酵液中甘油和1， 3-PD0的浓度用气相色谱法检测，色谱柱为大口径毛细管，0. 5 mm X20 m ，柱温170'C、气化室温度26(TC， 载气为氮气，流速50 mL/min ，采用内标 法(内标物质为l ， 62己二醇)定量。
产物分离发酵液离心后，上清液用油浴蒸馏得到1，3-PD0产品。
菌体生长的生物量用比色法检测(0D腳nm)。
丁酸梭芽孢杆菌(C7o"ri^/i;/z7 Zwt/ric"/z ) ATCC 8260的1， 3-丙二醇产量为15. 7 g/L,而重组菌为20.4 g/L。 丁酸梭杆菌的生长pH在6 7.5之间，其以甘油为底物的 发酵代谢的副产物主要为丁酸和乙酸，因而在发酵过程中的酸度的上升将会严重影响菌 体生长，同时抑制1， 3-PD0生成。由此可见要获得高产的1， 3-PD0在发酵过程中须将pH 控制在6. 5 7之间。如果将PHB的合成基因导入到细菌中，使得细菌对酸性条件的耐 受性增强，则可以在不用调节pH的条件下获得较高的1, 3-PD0产量。
实施例26、芽孢杆菌中表达p力Z^^提高细菌厌氧条件下的对原油的分解 菌种芽孢杆菌(^a^77"ssp) L-23(李清心，康从宝，王浩，张长铠，芽孢杆菌 发酵条件的优化及其在室内条件下提高原油采收率的初步研究，工业微生物，2002， 32:28-31)。
重组菌的获得将按照实施例l方法获得的质粒pEUHB以乙酸锂转化的方法转入到芽 孢杆菌(few77t/ssp) L-23中获得重组菌(含有pEUHB的芽孢杆菌(feci"ussp) L-23) 进行发酵实验。
种子培养基(g/U:葡萄糖20,蛋白胨2， Na2HP04 4， KH2P04 2， MgS04 0. 5， CaCl2 0. 005 ， pH 7.2。
发酵培养基(g/U:葡萄糖30， (NH4)2S04 15， Na2HP04 2， KH2P04 2， MgS04 0. 5 , pH 7. 2。
将芽孢杆菌(5ac/W"s sp) L-23和重组菌菌种分别接入种子培养基中，培养12 小时后，以体积分数IO y。的接种量分别接入发酵培养基中，发酵三角瓶500 mL ，装液 量为100 mL ，温度35'C，发酵时间48小时。
发酵液中菌体浓度测定
取培养液经6000 g离心30分钟后，用等量蒸馏水制成菌悬液，然后稀释，用722 型分光光度计于660 nm处测定菌悬液的OD值，事先作好标准曲线，求得标准曲线的方 程，然后依此测得发酵液中菌体浓度。
原油降粘实验将不同浓度的芽孢杆菌(^aw7^/s sp) L-23或重组菌的发酵液， 加入到来源不同的原油中，45'C培养24h，用离心机离心脱水后，再用粘度计测粘度的 变化，求出降粘率。对于来源不同的原油，细菌的降粘效果有所不同，可能是这些原油 的组成成分不同所致。原油中含有丰富的烃类、胶质、沥青质类等物质，从而使得原油 具有一定的粘度。细菌在原油中生长时可以利用原油中的成分作为其生长的碳源，因此， 对于其能降低原油粘度的原因分析有以下两种可能 一是通过对原油中烃类及其它物质 的降解使原油的粘度下降;二是微生物利用原油产生了一些代谢产物，这些产物的作用使 原油粘度下降。
通过野生菌(芽孢杆菌(^3w77"s sp) L-23)和转入PHB合成基因的重组菌的比 较可以看出，重组菌对于原油的降粘作用更为明显，以一种原油的结果为例，结果表明 重组菌在原油中的生长情况好于芽孢杆菌(5a"77"s sp) L-23，因而对原油的降粘效 果更好。这是由于PHB合成基因的转入使得细菌对渗透压的抗性提高，能在原油中更好 的生长。
表1野生菌和重组菌的降粘效果比较_
加入菌液占总体 ^ ， ^ r 化"t,、，， 0 0.5 1 25 积的百分比(％)_
原油粘度 210 204 196 183 151
野生菌降粘率
0 28 6.7 12.8 28.1
(%)原油粘度 210 重组菌降粘率 (%)
实施例27、在嗜酸乳杆菌中表达;^MM万提高细菌在酸性条件下的存活率 菌种嗜酸乳杆菌"acto6aci77〃s acit/op/^z7"s ) ATCC 53671。 按照实施例1的方法获得的质粒pEUHB以电转化的方法转入到嗜酸乳杆菌
(Za"o6aw77"s aw'&; /w'7ws ) ATCC 53671中获得重组菌(含有pEUHB的嗜酸乳杆菌
(Za"o力ac277"s ac』Vop/ i7〃s ) ATCC 53671)进行发酵实验。 实验方法如下
菌种传代培养基12. 8 g脱脂奶粉溶于100 mL蒸馏水中，121。C灭菌15 min。
计数培养基牛肉膏0.5%，蛋白胨1.0%，酵母膏0.6%，葡萄糖0.5%，琼脂L8 %， pH 6.8， 121。C灭菌20 min。
豆汁的制备将大豆室温(20'C左右)浸泡48小时，使大豆充分溶涨，磨浆(水 豆=3 : 1)，两层纱布过滤除去豆渣即得。115。C灭菌15 min。
不同pH值豆汁的制备以乳酸作为调节剂，将豆汁pH值分别调至4.0、 4.5、 5.0 或5.5。豆汁的自然pH值为6. 5左右，配制是在磁力搅拌器上进行，用pH酸度计监测。
保存实验嗜酸乳杆菌"actoybaciWws aci^p/L 7"s ) ATCC 53671和重组菌分别 于豆汁培养基(pH6. 5)中培养48小时，然后取菌液分别添加至不同pH值(4.0、 4.5、 5.0、 5.5)的灭菌豆汁中，使活菌数目为1 X 107-108 Cfu/ml，置于4'C冰箱中保存10周， 检测活菌数目变化。其中，计数方法根据样品中含菌量的不同，作10倍系列浓度稀释， 倒平板，37'C恒温培养72小时，计菌落数。存活率的计算存活率=样品的活菌数目/样 品中起始活菌数目X100 %。
结果表明嗜酸乳杆菌aacto6acj77"s acicb; / j7iAS ) ATCC 53671在不同的pH值的 豆汁中保存，存活率不同，pH4.0下存活率最低(2%) ， pH5.0最高(llM)。在pH4. 5-pH 5.5中保存，存活率变化不明显都在9%左右。10周保存实验的结果表明，pH5.5下的存 活率(9%)仅高于pH4.5 (8.2%)下的不足一倍。从活菌数目上看，10周后pH4.0下 活菌数目仍能维持在lX106cfu/ml以上水平，pH4. 5-5. 5都在lX107cfu/ml以上水平。
重组菌的存活率在实验的几个pH (4.0、 4.5、 5.0、 5.5)下变化不明显，都在20% 左右，活菌的数目较野生菌有明显的提高，10周保存实验的活菌数目均在lX107cfu/ml 以上水平。表明PHB的合成提高了细菌在酸性条件下的活菌数目。
重组的嗜酸乳杆菌在较低pH值(4.0、 4.5)培养条件下具有较高的存活率和活菌数 目在生产上具有重要的意义 一方面可以提高存活率，使制剂具有较高的活菌数另一 方面，较低的PH值环境可防止杂菌污染。
实施例28、从脂肪酸e—氧化途径合成PHA的相关基因在荧光假单胞菌中的表达影 响葡萄糖酸产量
202 190 171 133
3.8 9.5 18.6 36.7菌禾中- 焚光假单胞菌(/^ei/ob/Z7(m351 /7woresce/750 AS 1.55。 斜面培养基成分为牛肉膏0.5%，蛋白胨1%， NaC10.5%，琼脂2 %， pH7. 0。 种子培养基成分为葡萄糖2 %，玉米浆1 %，尿素0.2 %， KH2P04 0.2 %， MgS04 7H20 0. 05 %， pH7. 0。
发酵培养基成分为淀粉水解糖14%,玉米浆1.5%,轻质碳酸钙4%， pH6.7。 在标准的聚合酶链式反应条件下，以质粒pEE32(Fukui T， Doi Y. Cloning and analysis of the poly (3-hydroxybutyrate-co_3_hydroxyhexanoate) biosynthesis gene of爿ara7 o/ as caWae. J. Bacteriol., 1997, 179:4821-4830)为禾莫板，用引物 TAAGGTACCGAAGGAGAGCACATGAGCCA和TCTAAGCTTGGCTGATTGTGCCTGCGTG扩增出p/ aC庙因， 然后经过A^/7l和历/7c7J7酶切处理后，插入到质粒pBBRlMCS2的限制性内切酶Jp"I和 历/^///的识别位点间，获得质粒pBBRCJ。 pBBRCJ以电转化的方法转入到荧光假单胞菌 (尸sei/t/a7 o朋s /7"oresce/7s) AS 1. 55中获得重组菌(含有pBBRCJ的荧光假单胞菌 (/^e〃ob历o朋s /7〃oresce/7S) AS 1.55)进行发酵实验。
分别取培养在新鲜斜面上的荧光假单胞菌(尸sei/^^o/73S/7"oresce/^) AS 1. 55和 重组菌分别接种到种子培养基(50 mL/500 mL锥形瓶)，在30。C、 230 rpm下培养16小时 后，以10M(v/v)接种量分别接入发酵培养基。发酵瓶500 mL装液量50 mL，在30。C、 230 rpm 下培养72小时，测定发酵液中酮基葡萄糖酸含量。发酵液中酮基葡萄糖酸含量用旋光法 测定发酵液中酮基葡萄糖酸含量二25。C下发酵液旋光度绝对值/0. 88。
结果表明荧光假单胞菌(/^ei/ob历朋as/7"oresce/7s) AS 1. 55的发酵液中酮基葡萄 糖酸含量为13.6 g/L，重组菌的产量为15.8 g/L，提高了大约16 %， p力aC庙因的导入， 能够在细胞内积累PHA，有利于提高菌的的耐受力，生长得更好，从而得到更高的转化率。 实施例29、从脂肪酸从头合成途径合成PHA的相关基因在枯草芽孢杆菌中的表达影 响肌苷的生物合成
菌种枯草芽孢杆菌(5濃77"s s"Z "7is ) ATCC 19162。
种子培养基成分为葡萄糖20 g/L，酵母粉15 g/L,蛋白胨10 g/L，玉米液7 g/L，氯化 钠2.5 g/L，尿素2 g/L， pH值7.0。
发酵培养基成分为葡萄糖140 g/L，玉米液16 g/L，酵母粉16 g/L，尿素9 g/L，硫酸铵 16 g/L，七水硫酸镁4 g/L，磷酸氢二钾5 g/L，碳酸钙20 g/L， pH值7. 0。
在标准的聚合酶链式反应条件下，以质粒pQH-CG(邱远征，聚羟基丁酸羟基己酸酯生 物合成途径的基因工程改造，清华大学，2005，博士论文。)为模板，用引物 ATACGACTCACTATAGGGC和AGTGCCAGATCTCGCAACGCAATTAATG扩增出p/ aC"堪因，然后经过 fey^I和j5^II酶切处理后，插入到质粒pEU308的限制性内切酶BglII和BamHI的识别位点 间，获得质粒pEUGC。 pEUGC以乙酸锂转化的方法转入到枯草芽孢杆菌(^aw'77"s sw力^7八)ATCC 19162中获得重组菌(含有pEUGC的枯草芽孢杆菌(万aci""s卯6"乃's ) ATCC 19162)进行发酵实验。
分别取培养在新鲜斜面上的枯草芽孢杆菌(&ci77〃s s"Z "7is ) ATCC 19162和重组菌分别接种到种子培养基(50 mL/500 mL锥形瓶)，在32'C、 200 rpm下培养l2小时后， 以5M(v/v)接种量接入发酵培养基。7.5L发酵罐装液量3L,自动控制温度35。C， pH 6. 5, 搅拌速度600 rpm，通气量l L/min,发酵时间68小时(肌苷产量不再增加)，测定发酵液 中肌苷含量。肌苷含量用HPLC测定，流动相为0.5 %磷酸氢二钾，流速1.2 mL/min,色谱 柱为Hypersil ODS C18反相柱，检测波长为254nm。结果表明枯草芽孢杆菌(fe"7Ji^ s〃6"7is ) ATCC 19162的肌苷产量为19.7 g/L，重组菌的产量为24. 9 g/L，提高了26. 4 %。在细胞内代谢途径中，为肌苷合成提供前体的单磷酸己糖途径会消耗大量的NADP，同 时从6-磷酸葡萄糖到磷酸戊糖途径的调控酶6-磷酸葡萄糖脱氢酶受到NADPH的反馈抑制， 因此NADPH的减少能促进葡萄糖向磷酸戊糖途径的转化。总的来说，肌苷合成是一个需要 大量氧化力的生化代谢过程，高的NADP/NADPH水平能够有效的促进肌苷的合成。C 基因的引入，能够促进脂肪酸的从头合成途径，提高细胞内的氧化力，因此能够显著的 提高肌苷的产量。
实施例30、在移动假单胞菌中表达p力MM感因影响乙醇产量
菌种移动假单胞菌(^moMwas历o&'h's ) NRRL B-4286。
斜面培养基成分为葡萄糖10 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母粉15 g/L，磷酸二氢钾 1 g/L，硫酸铵1 g/L，七水硫酸镁1 g/L， NaCl 1 g/L，琼脂15 g/L， pH值7. 0。 种子培养基成分为葡萄糖100 g/L，酵母粉15 g/L，蛋白胨10 g/L， pH值7.0。 发酵培养基成分为葡萄糖200 g/L,酵母粉15 g/L，蛋白胨10 g/L， pH值7. 0。 将按照实施例ll的方法获得的质粒pBBRHB以电转化的方法转入到移动假单胞菌 (》朋o历o朋s /77oZ j7A ) NRRL B-4286中获得重组菌(含有pBBRHB的移动假单胞菌 (2y/z7OTO/ as历oZ^7A ) NRRL B-4286)进行发酵实验。
分别取培养在新鲜斜面上的移动假单胞菌(Z/z/royro/^s/^Z^h's ) NRRL B-4286和重 组菌分别接种到种子培养基(50 mL/500 mL锥形瓶)，在3(TC、 200 rpm下培养16小时后， 以IO M(v/v)接种量分别接入发酵培养基。发酵瓶500 mL装液量50 mL，在30'C、 200 rpm 下培养72小时，测定发酵液中的乙醇含量。乙醇浓度用高效液相色谱测量发酵液8000 g 离心十分钟，取上清过滤后作为样品；色谱柱为Beckman公司L2Spherogel配合基交换柱， 流动相为98%的浓硫酸:仏0(体积比为0. 5:1000)，流速l mL/min。
结果表明野生菌的发酵液乙醇浓度为14 %，重组菌的乙醇浓度为18 %，提高了28 %， / 力力^堪因的引入，不仅可以改变细胞内的代谢流，而且PHA的合成能够提高细菌对 高乙醇环境的耐受性，从而提高了乙醇的产量。序列表
<160〉1
<210〉1
<211>3884
〈212>DNA
〈213> feyterw'a ei/tropAg
<400>1
ataaagcttaaggaggatggcgaccggcaaaggcgcggcagcttccacgcaggaaggcaa60
gtcccaaccattcaaggtcacgccggggccattcgatccagccacatggctggaatggtc120
ccgccagtggcagggcactgaaggcaacggccacgcggccgcgtccggcattccgggcct180
ggatgcgctggcaggcgtcaagatcgcgccggcgcagctgggtgatatccagcagcgcta240
C3tg33gg3Cttctcagcgctgtggcaggccatggccgagggcaaggccgaggccaccgg300
tccgctgcacgaccggcgcttcgccggcgacgcatggcgc3CC朋CCtCCcatatcgctt360
cgctgccgcgttctacctgctcaatgcgcgcgccttgaccgagctggccgatgccgtcga420
ggccgatgccaagacccgccagcgcatccgcttcgcgatctcgcaatgggtcgatgcgat480
gtcgcccgccaacttccttgccsccastcccgaggcgcagcgcctgctgatcgagtcggg540
cggcgaatcgctgcgtgccggcgtgcgcaacatgatggasgacctgacacgcggca卿t600
ctcgcagaccgscg卿gcgcgtttgaggtcggccgcaatgtcgcggtgaccgaaggcgc660
cgtggtcttcgagaacgagtacttccagctgttgcagtacaagccgctgaccgacaaggt720
gcacgcgcgcccgctgctgatggtgccgccgtgcatcaacaagtactacatcctggacct780
gcagccggagagctcgctggtgcgccatgtggtggagcagggacatacggtgtttctggt840
gtcgtggcgcaatccggacgccagcatggccggcagcacctgggacgactacatcgagca900
cgcggccatccgcgccatcg朋gtcgcgcgcgacatcagcggccaggaca3g8tCEl3Cgt960
gctcggcttctgcgtgggcggcaccattgtctcgaccgcgctggcggtgctggccgcgcg1020
cggcgagcacccggccgccagcgtcacgctgctgaccacgctgctggactttgccgacac1080
gggcatcctcgacgtctttgtcgacgagggccatgtgcagttgcgcgaggccacgctggg1140
cggcggcgccggcgcgccgtgcgcgctgctgcgcggccttgagctggccaataccttctc1200
gttcttgcgcccgaacgacctggtgtggaactacgtggtcgacaactacctg卿ggcaa1260
cacgccggtgccgttcgacctgctgttctggaacggcgacgccacc肪cctgccggggcc1320
gtggtactgctggtacctgcgccacacctacctgcagaacgagctcaaggtaccgggcaa1380
gctgaccgtgtgcggcgtgccggtggacctggccagcatcgacgtgccgacctatatcta1440
cggctcgcgcgaagaccateitcgtgccgtggaccgcggcctatgcctcgaccgcgctgct1500
ggcgaac幼gctgcgcttcgtgctgggtgcgtcgggccatatcgccggtgtgatcaaccc1560
gccggccaagaa_c33gcgc3gccactggactaacgatgcgctgccggagtcgccgcagca1620
atggctggccggcgccatcgagcatcacggcagctggtggccggactggaccgcatggct1680ggccgggcag cgcaatcgaa ccggcgtgcg ggactacaca tggcggctcg gctggagcgc gaccgccggt gatggtgccg ggccgccaac catgagcgcc caagctggtc gggcatcacc gttcgccgtc agagatcgtc cgagttcgtg caaggccggc ggtggtgatg gagctatgcc caagcgcgcc cgaggccttt ggtcaatgtg tatcctggtg gctgtgcatc ttttccgggg gtgg織tga atttgccagc ccgcgccgcg gaaggc肌tg gtcggcgagg aagatgaccc gtcacc犯gc tcgtcggtga ggcctgcatg aacacggtct ctcgacaaga tcgatctgcg ctcaacggcg
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1740 1800 1860 1920 1980 2040 2100 2160 2220 2280 2340 2400 2460 2520 2580 2640 2700 2760 2820 2880 2940 3000 3060 3120 3180 3240 3300 3360 3420 3480 3540 3600 3660 3720 3780 3840 388权利要求
1、一种提高微生物抗逆性的方法，是在微生物中合成聚羟基脂肪酸酯；所述聚羟基脂肪酸酯的合成是通过在所述微生物中引入聚羟基脂肪酸酯合成途径的相关基因而实现的；所述微生物为移动假单胞菌(Zymomonas mobilis)；所述聚羟基脂肪酸酯合成途径的相关基因为phbCAB基因，所述phbCAB基因的碱基序列如SEQ ID NO1所示；所述逆境胁迫为低pH胁迫或高渗透压胁迫。
2、 根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述移动假单胞菌为移动假单 胞菌NRRL B-4286。
全文摘要
本发明公开了调控微生物代谢及提高微生物抗逆性的方法。本发明所提供的调控微生物代谢及提高微生物抗逆性的方法，是在微生物中合成聚羟基脂肪酸酯；所述聚羟基脂肪酸酯的合成是通过在所述微生物中引入聚羟基脂肪酸酯合成途径的相关基因而实现的。将本发明的方法应用到各种微生物生产菌中，可以有效的影响生产菌的代谢途径，增加菌的抗逆性，提高包括透明质酸、丙酮酸、麦角固醇、啤酒、肌苷、弹性蛋白酶、类胡萝卜素、谷氨酰胺、赖氨酸、苯丙氨酸、葡萄糖酸、淀粉酶、酒精、甘油、十二碳二元酸、十五碳二元酸、苏云金杆菌粉剂、鸟苷、谷胱甘肽、赤藓糖醇、D-核糖，1，3-丙二醇等生物工程产品的生产效率。
文档编号C12N15/74GK101665801SQ20091017809
公开日2010年3月10日 申请日期2005年4月26日 优先权日2005年4月26日
发明者琼 吴, 张晋宇, 陈国强 申请人:清华大学