一种稳定高产脂肪酶的黑曲霉突变菌株的制作方法
【专利摘要】本发明的目的是提供一种稳定、高产脂肪酶的黑曲霉突变菌株，其保藏编号为CCTCC NO：M2014584。本发明采用紫外诱变的方法获得一株突变菌株黑曲霉CALB7-7，该菌株能稳定、高效重组表达脂肪酶CALB，其发酵酶活高达210U/mL，比出发菌提高了75％。此外，该突变菌株重组表达的脂肪酶CALB的最适作用温度为45℃，最适作用pH值为7.0，与出发菌株相同，脂肪酶CALB的酶学性质未发生改变。因此，该突变菌株可有效应用于脂肪酶CALB的发酵生产，有利于实现脂肪酶CALB在工业领域的广泛使用。CCTCC NO: M 201458420141121
【专利说明】一种稳定高产脂肪酶的黑曲霉突变菌株
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物诱变筛选【技术领域】，具体涉及一种稳定高效表达脂肪酶的黑曲 霉（Asperillus niger)突变菌株。
【背景技术】
[0002] 脂肪酶（E.C. 3. 1. 1.3)又名甘油酯水解酶、三酰基甘油酰基水解酶，是一类可以 水解甘油三酯产生不同链长游离脂肪酸和甘油的水解酶。从催化特性看，它具有高度的化 学选择性和立体异构性，且反应不需辅酶，反应条件温和，副产物少。脂肪酶的一个显著特 征是它不同于多数水解酶的催化特性，它是一类非水相酶，其催化反应是在油水界面上进 行，对于水溶性底物不起催化作用。因此脂肪酶广泛应用于有机合成当中，已成为市场上的 第三大工业用酶。
[0003] 1994 年 Uppenberg et al.公布了脂肪酶 CALB (Candida Antarctica Lipase B) 的氨基酸序列和三维（3D)结构。所述3D结构可以在结构生物信息学蛋白质数据库（RCBS PDB) (http://www.rcsb. org/)中找到，其识别号为1TCA。该酶具有宽广的底物谱，可催化 底物的酯化、醇解、酸解、酯交换等反应，用于手性胺、手性醇等中间体的催化合成方面。具 有方法简单、条件温和、能耗低、副产物价值高的优点。但目前国外酶制剂企业垄断经营的 脂肪酶CALB表达量普遍较低，因此价格居高不下，不适合其在催化领域的进一步应用。在 我国乃至世界精细化学品、中间体生产的工业化过程中，急需获得酶活单位高，生产成本低 廉的工业化脂肪酶生产菌株。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种稳定、高产脂肪酶的黑曲霉突变菌株，本发明将构建得 到的重组表达脂肪酶CALB的黑曲霉工程菌株进行紫外诱变和突变筛选，从而获得了一株 稳定性好、脂肪酶产量高的黑曲霉突变株，为脂肪酶CALB的工业化生产奠定了基础，从而 弥补现有技术的不足。
[0005] 本发明一方面提供了一株突变菌黑曲霉CALB7-7 (Aspergillus niger CALB7-7)， 已于2014年11月21日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为 CCTCC NO :M2014584。
[0006] 上述的突变菌黑曲霉CALB7-7,是将转化有携带编码脂肪酶基因的重组质粒的黑 曲霉菌株进行紫外诱变获得的；
[0007] 所述的脂肪酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO:2 ;其编码基因的序列为SEQ ID NO: 1。
[0008] 本发明的黑曲霉CALB7-7用于生产脂肪酶。
[0009] 本发明采用紫外诱变的方法获得一株突变菌株黑曲霉CALB7-7,该菌株能稳定、高 效重组表达脂肪酶CALB，其发酵酶活高达210U/mL，比出发菌提高了 75%。此外，该突变菌 株重组表达的脂肪酶CALB的最适作用温度为45°C，最适作用pH值为7. 0,与出发菌株相 同，脂肪酶的酶学性质未发生改变。因此，该突变菌株可有效应用于脂肪酶CALB的发酵生 产，有利于实现脂肪酶CALB在工业领域的广泛使用。
【专利附图】
【附图说明】
[0010] 图I :12% SDS-PAGE电泳检测分析图谱；
[0011] 其中泳道M为蛋白标准分子量标记；泳道1所示为对照宿主菌黑曲霉Gl发酵上 清液中蛋白表达情况；泳道2所示为出发菌黑曲霉Cll发酵上清液中蛋白表达情况；泳道 3-10所示为8株突变菌发酵上清液中蛋白表达情况，箭头所指33kDa处的蛋白条带即为重 组表达的脂肪酶CALB。
【具体实施方式】
[0012] 下面结合实例对本发明的方法做进一步说明。下列实施例中未注明具体条件的实 验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克（Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中 所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。本领域相关的技术人员可以借助实施例 更好地理解和掌握本发明。但是，本发明的保护和权利要求范围不仅限于所提供的具体案 例，而应包括本领域技术人员在本说明书基础上，不需经过创造性劳动就能扩展的保护范 围。
[0013] 实施例1脂肪酶基因的合成及扩增
[0014] 根据NCBI公布的脂肪酶CALB的基因序列（GeneBank Z30645. 1)，在其起始密码子 ATG前增加8个碱基TCTAGAGC (下划线所示为XbaI酶切位点），在其终止密码子TGA后增 加9个碱基CCGCTCGAG(下划线所示为XhoI酶切位点），然后将此序列根据黑曲霉密码子偏 好性进行密码子优化，优化后的基因序列为SEQ ID N0:1，并由南京金斯瑞生物科技有限公 司合成。
[0015] 用限制性内切酶XbaI和XhoI (Fermentas)对脂肪酶基因进行酶切；同时，用限制 性内切酶XbaI和XhoI对质粒TpGM进行酶切。使用凝胶纯化试剂盒将酶切产物纯化，并用 T4DNA连接酶（Fermentas)将上述两个酶切产物连接。将连接产物转化进DH5a大肠杆菌， 用氨苄青霉素进行选择。为确保准确，对若干克隆进行测序（Invitrogen)，测序结果显示获 得的DNA序列为SEQ ID NO: 1，其编码的蛋白序列为SEQ ID NO: 2。
[0016] 使用质粒小量制备试剂盒（Axygen)从测序结果正确的大肠杆菌克隆中纯化质 粒。获得1个重组质粒为TpGM-calb。
[0017] 实施例2黑曲霉工程菌株的构建
[0018] 吸取黑曲霉Gl孢子悬浮液于PDA平板，待菌落长满整个培养皿，切1/4大小的培 养基于200mL CMA液体培养基中，在30°C、200rpm下培养14?16h。
[0019] 用无菌Miracloth滤布收集菌丝体，并用溶液A清洗一次，在无菌条件下将清洗过 的菌丝体转移到40mL原生质体转化溶液中，在30°C、200rpm的条件下温浴2?3h，显微镜 观察原生质体以确保裂解完全。
[0020] 用无菌Miracloth滤布过滤上述温浴液体，所得滤液即为原生质体溶液。将原生 质体溶液分装于两个50mL -次性无菌离心管中，并将每管的体积用溶液B定容至45mL，在 3000rpm条件下离心IOmin以获得沉淀并弃去上清液。用20mL溶液B再次悬浮并清洗沉淀 两次。将沉淀重悬于IOmL溶液B中，并用血球计数板对原生质体计数。将原生质体再次离 心并弃去上清液，根据血球计数板计数结果，加入适量溶液B重悬沉淀，使得原生质体数目 在 IX IO7个/mL。
[0021] 在冰上，将200 μ L上述原生质体溶液加入预冷的无菌15mL离心管中，每个转化 反应用1管，再加入10 μ g突变体重组质粒TpGM-calb，50 μ L溶液C，温和混匀后冰上放置 20min〇
[0022] 将丽SA顶层琼脂糖融化并保持在55°C。从冰中移出上述15mL离心管，并向管中 加入2mL溶液C，室温静置5min后加入4mL溶液B，温和混匀各管，所得混合物即为原生质 体混合物。向顶层琼脂培养基中加入上述原生质体混合物，并立即混匀后倾倒于MMSA平板 上，室温静置待凝固后将平板在30°C下培养7?10d。
[0023] 溶液 A :2. 5mL IM Κ2ΗΡ04,2· 5mL IM ΚΗ2Ρ04,48· 156g MgSO4,加入 dlH20 至终体积 500mL，用0. 22 μ m的微孔滤膜过滤除菌。
[0024] 溶液 B :5mL IM Tris(pH 7. 5)，2. 77g CaCl2,109. 32g 山梨醇，加入 dlH20 至终体积 500mL，用0. 22 μ m的微孔滤膜过滤除菌。
[0025] 溶液 C :250g PEG 4000,2· 77g CaCl2,5mL IM Tris(pH 7. 5)，加入 dlH20 至终体积 500mL，用0. 22 μ m的微孔滤膜过滤除菌。
[0026] CMA培养基：20g葡萄糖，20g麦芽浸出物，Ig蛋白胨，15g琼脂，加入dlH20至终体 积1000mL，高压蒸气灭菌。
[0027] 实施例3黑曲霉工程菌株发酵验证及酶活测定
[0028] 质粒TpGM-calb通过原生质体转化法转入黑曲霉宿主菌Gl中，得到23个黑曲霉 转化子（分别命名为C1，C2，C3，……，C23)。将上述转化子接种至PDA固体平板上进行富 集活化，在30°C恒温培养箱中倒置培养5-6d。从所述23个转化子PDA孢子平板上割取约 4cm 2的菌块切碎接种至50mL TSB发酵培养基中，在30°C，200rpm的条件下培养5d ;将所得 发酵液在8500rpm条件下离心lOmin，收集上清液；将上清液在浓度为12%的SDS-PAGE胶 上进行电泳，同时以宿主菌黑曲霉Gl的发酵上清液作为对照。电泳结果显示，本发明构建 得到的转化子 C7、C9、C10、Cll、C15、C16、C17、C19、C20、C21、C22、C23 在 33kD 处都有明显 的蛋白条带，与本发明所述脂肪酶CALB的理论分子量一致，而对照宿主菌黑曲霉Gl所在泳 道中33kD处无明显的蛋白条带，从而说明上述阳性转化子均能重组表达脂肪酶CALB。
[0029] 挑选其中脂肪酶蛋白表达量较高的五个阳性转化子C10、Cll、C16、C17和C20,分 别测定其发酵上清液的脂肪酶酶活，同时以宿主菌黑曲霉Gl的发酵上清液作为对照。结果 显示，宿主菌黑曲霉Gl的发酵上清液中未检测出脂肪酶酶活，而阳性转化子黑曲霉Cll的 发酵上清液中脂肪酶酶活为120U/mL，从而说明黑曲霉Cll能重组表达脂肪酶CALB。
[0030] 脂肪酶酶活力测定方法
[0031] 根据《GB/T 23535脂肪酶制剂》所述方法检测黑曲霉发酵液酶活，酶活力定义：lg 固体酶粉（或ImL液体酶），在30°C，pH8. 0的条件下，Imin水解三丁酸甘油酯产生1 μ mol 的可滴定的脂肪酸，即为一个酶活力单位，以U/g(U/ml)表示。
[0032] 实施例4紫外诱变与筛选
[0033] 4. 1紫外诱变方法
[0034] (1)将上述构建得到的黑曲霉Cll作为出发菌株，将其接种到PDA固体平板上活 化，在30°C下培养5d;
[0035] (2)用棉签刮取平板上的孢子溶于20ml无菌水中制得新鲜孢子悬液，吸取IOul置 于血球计数板上计数，根据计数结果稀释孢子悬液至孢子数目约为IO 6个/ml左右；
[0036] (3)吸取15ml稀释后的孢子悬液置于d = 9cm培养皿中，在紫外灯9w、照射距离 22cm进行诱变，分别在照射时间3min、4min、5min、6min、7min、8min、IOmin时取样lml，筛选 合适的照射条件，使致死率达到95%。
[0037] (4)紫外照射完毕后，将诱变后的孢子悬液稀释1000倍至103,吸取稀释后的孢子 悬液涂布PDA平板，每个PDA平板涂IOOul，每个时间梯度涂布三个平板。另外不经紫外照 射的孢子悬液稀释至IO 2个，吸取IOOul同样涂布三个PDA平板作为诱变前对照，在30°C下 避光培养35-40h。根据平板上平均长出的菌落数计算达到95%致死率所需的紫外照射时 间，结果，选取7min作为合适的紫外照射时间。
[0038] (5)结合上述优化后的紫外诱变条件，新鲜孢子液经照射后稀释1000倍，吸取 IOOul涂布PDA平板，共涂布60个平板，在30°C下避光培养35-40h。待菌落未长孢子之前， 挑取平板上长出的个体形态小、菌丝浓密且紧实的突变菌落，于另一 PDA平板上点种富集， 富集活化平板在30°C下培养3-4d ;
[0039] 4. 2突变菌株的筛选
[0040] 1、初筛
[0041] 根据PDA平板上诱变菌株的生长情况，挑选长势相近的诱变菌株分批进行发酵表 达，同时以出发菌株黑曲霉Cll作对照。发酵采用一步摇瓶发酵法：将黑曲霉诱变菌株割取 约4cm2菌丝块切碎后分别接种于50mL发酵培养基中，每个菌株接1瓶，在30°C，200rpm的 条件下培养5d ;将所得发酵液在8500rpm条件下离心lOmin，收集上清液；将上清液在浓度 为12%的SDS-PAGE凝胶上进行电泳，通过观察比较脂肪酶重组蛋白条带的表达量，挑选出 8株脂肪酶表达量明显高于出发菌的突变菌株。
[0042] 上述8株突变菌发酵上清液的12% SDS-PAGE电泳检测分析图谱如图1所示：泳道 1所述宿主菌黑曲霉Gl的发酵上清液在33kD处无明显的蛋白条带，泳道2所述出发菌黑曲 霉Cll发酵上清液和泳道3-10所述8株突变菌株的发酵上清液，在33kD处均有明显的蛋 白条带，且泳道3-10的蛋白条带比泳道2的蛋白条带更粗，颜色更深，从而说明上述得到的 8株突变菌仍能有效的重组表达脂肪酶CALB，且脂肪酶CALB的表达量显著高于出发菌。
[0043] 2、复筛
[0044] 将挑选出的8株突变菌株再次进行发酵表达，同时以出发菌株黑曲霉Cl 1作对照。 发酵采用两步摇瓶发酵法：将黑曲霉诱变菌株的孢子悬浮液接种于50ml发酵培养基（柠檬 酸三钠·2Η 20(10% )、（NH4)2S04(2. 1% )、NaH2P04 . Η20(0· 15% )、Tween 80(0. 15% )、胰蛋 白胨大豆肉汤（6.4%)、微量元素（0.15%)、无水0&(：12(0.08%)、]\%50 4.7!120(0.15%)、 40%麦芽糖（30%)。定容至1L，高压蒸气灭菌）中，在30°C，200rpm的条件下培养48h;然 后按1〇%接种量，吸取51111培养液菌体接种于5〇1^发酵培养基中，在30°0,200印111的条件 下培养5d ;将所得发酵液在8500rpm条件下离心lOmin，收集上清液。
[0045] 将上述8株突变菌株的发酵上清液分别进行脂肪酶酶活测定，最终挑选出一株脂 肪酶CALB表达量最高的突变菌株，其发酵上清液的脂肪酶酶活为210U/mL，比出发菌提高 了 75%。
[0046] 申请人:将该突变菌株命名为黑曲霉CALB7-7 (Aspergillus niger CALB7-7)，并已 于2014年11月21日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为 CCT CC NO :M2014584。
[0047] 实施例4酶学性质分析
[0048] 1、最适作用pH值
[0049] 分别配制pH值为7. 0、8. 0、9. 0、10. 0、11. 0、12. 0、13. 0的甘氨酸-氢氧化钠缓冲 液。将突变菌株黑曲霉CALB7-7和出发菌株黑曲霉Cll的发酵上清液分别用上述缓冲液稀 释至合适的浓度，然后按照GB/T 23535所述方法测定发酵上清液中重组脂肪酶的酶活力。 以原始酶活为100%，计算不同PH条件下重组脂肪酶的相对酶活。结果显示，突变菌株黑曲 霉CALB7-7和出发菌株黑曲霉Cll发酵上清液中重组脂肪酶相对酶活-pH变化曲线相同， 最适作用pH均为7.0。
[0050] 2、最适作用温度
[0051] 将突变菌株黑曲霉CALB7-7和出发菌株黑曲霉Cll的发酵上清液用上述pH7.0 的缓冲液稀释至合适的浓度，按照制造商的说明书，分别在25°C、30°C、35°C、40°C、45°C、 50°C、55°C、60°C条件下，按照GB/T 23535所述方法测定发酵上清液中重组脂肪酶的酶活 力。以原始酶活为100%，计算不同温度条件下重组脂肪酶的相对酶活。结果显示，突变菌 株黑曲霉CALB7-7和出发菌株黑曲霉Cll发酵上清液中重组脂肪酶相对酶活-温度变化曲 线相同，其最适作用温度均为45°C。
[0052] 综上所述，突变后的黑曲霉CALB7-7重组表达的脂肪酶CALB的酶学性质与突变前 相同，最适作用pH均为7. 0,最适作用温度均为45°C。
【权利要求】
1. 一株黑曲霉，其特征在于，所述的黑曲霉的保藏编号为CCTCC NO :M2014584。
2. 权利要求1所述的黑曲霉，其特征在于，所述的黑曲霉是将转化有用于表达脂肪酶 的重组质粒的黑曲霉菌株进行紫外诱变获得的。
3. 如权利要求1所述的黑曲霉，其特征在于，所述的脂肪酶，其氨基酸序列为SEQ ID N0:2〇
4. 如权利要求3所述的黑曲霉，其特征在于，所述的脂肪酶，其编码基因的序列为SEQ ID N0:l〇
5. 权利要求1所述的黑曲霉在生产脂肪酶中的应用。
【文档编号】C12N9/20GK104480028SQ201410777845
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年12月16日 优先权日:2014年12月16日
【发明者】宋清清, 徐晓东, 徐娟, 吴佳鹏, 黄亦钧, 王华明 申请人:青岛蔚蓝生物集团有限公司