步骤二、真皮层的构建:
1、P8代成纤维细胞消化后，于800rpm/min条件下离心5min。在含有70μ g/ml Vc以及体积比为10%的胎牛血清(FBS)的a -MEM培养基中重悬，以每孔0.12Ε6密度接种至步骤一的脂肪层，保证小室内液量150 μ 1，在5% C02、37°C的孵箱中培养；
2、24h后，重复步骤1，在5%C02、37°C的孵箱中培养2d，每隔24h换液，保证小室内液量 150 μ L.
[0022]步骤三、表皮层的构建:
1、Ρ4代表皮细胞培养融合率达60%左右时，消化细胞并于800rpm/min条件下离心6min，用构建培养液SKcl重悬，以1.5E5/孔的细胞密度接种至步骤二的真皮层中。其中，SKcl阶段为液下培养方式，保证小室内液量150 μ 1，于5% C02、37°C的孵箱中培养，每24h
换液一次；
2、培养2d后，更换成构建培养液SKc2，并进行气液面培养，将步骤I中Transwell小室的培养液吸去，保持人工皮肤表面的干燥，随后在5% CO2,370C的孵箱中培养2d，每24h换液一次；
3、2d后，更换成构建培养液SKc3，并进行气液面培养，在5%CO2,370C的孵箱中培养2d，每24h换液一次；
4、3d后，更换成成构建培养液SKc4，并进行气液面培养，在5%CO2,370C的孵箱中培养2d，每24h换液一次；
不同构建用液的所含成分具体如下:
构建基础培养基为DMEM
构建培养液SKcl是在DMEM培养液中添加体积比分别为10%的胎牛血清(FBS)，0.1ng/ml的EGF，0.15 μ g/ml的地塞米松，5 μ g/L的胰岛素(INSULIN)，30 μ g/ml的腺嘌呤，0.15nM 的 Thyroxine (T3)，4 μ g/ml 维甲酸；
构建培养液SKc2是在DMEM培养液中添加体积比分别为10%的胎牛血清(FBS)，添加
0.25 mM 的 CaC12，0.1 ng/ml 的 EGF，35 μ g/ml 的 Vc, 0.15 μ g/ml 的地塞米松，5 μ g/L 的胰岛素(INSULIN), 30 μ g/ml 的腺嘌呤，0.15nM 的 Thyroxine (T3)，4 μ g/ml 维甲酸；
构建培养液SKc3是在DMEM培养液中添加体积比分别为5?10%的胎牛血清(FBS)，添加 0.5mM 的 CaCl2,0.1 ng/ml 的 EGF，35 μ g/ml 的 Vc, 0.15 μ g/ml 的地塞米松，5 μ g/L 的胰岛素(INSULIN), 30 μ g/ml 的腺嘌呤，0.15nM 的 Thyroxine (T3)，4 μ g/ml 维甲酸；
构建培养液SKc4是在DMEM培养液中添加体积比分别为10%的胎牛血清(FBS)，添加ImM 的 CaC12，0.1 ng/ml 的 EGF，0.15 μ g/ml 的地塞米松，5 μ g/L 的胰岛素(INSULIN)，30 μ g/ml 的腺嘌呤，0.15ηΜ 的 Thyroxine (T3), 4 μ g/ml 维甲酸。
[0023]实施例2:
步骤一、脂肪层的构建
1、将P5代的脂肪间充质干细胞消化后，800rpm/min条件下离心8min。用体积比为10%胎牛血清(FBS)的a -MEM培养基中重悬，以每孔0.15Ε6密度接种至Transwell小室，小室内保持加液量150 μ 1，在5% C02、37°C的孵箱中培养24h ;
2、24h后更换培养液为成脂诱导液，于5%CO2、37°C的孵箱中培养5d，每隔2d换液；
3、5d后，重复步骤1，24h后更换小室内外培养液为成脂诱导液，5%C02、37°C孵箱中培养3d，每隔24h更换小室内液体，加液量同上。
[0024]成脂诱导液组成:a -MEM培养基作为基础液，其中添加体积比分别为10%的胎牛血清(FBS)，卩引噪美辛 0.05mg/ml，IBMX 0.5mg/ml，胰岛素 0.04mg/ml，地塞米松 0.8 μ g/ml。
[0025]步骤二、真皮层的构建:
1、P8代成纤维细胞消化后，离心机中800rpm/min条件下离心Smin。细胞随后用含有25 μ g/ml Vc以及体积比为10%的胎牛血清(FBS)的a -MEM培养基中重悬，吸去步骤一小室内原有液体。以每孔0.15Ε6密度接种，保证小室内液量150 μ 1，在5% C02、37°C的孵箱中培养；
2、24h后，重复步骤1，在5%C02、37°C的孵箱中培养4d，每隔24h换液。
[0026]步骤三、表皮层的构建:
1、P6代表皮细胞培养融合率达70%左右时，消化细胞，800rpm/min条件下离心6min，构建培养液SKcl重悬细胞，2E5/孔的细胞密度接种至步骤二的真皮层中。其中，SKcl阶段为液下培养方式，保证小室内液量150 μ 1，于5% C02、37°C孵箱中培养，24h换液一次；
2、培养3d后，更换成构建培养液SKc2，并进行气液面培养，并进行气液面培养，将步骤I中Transwell小室的培养液吸去，保持人工皮肤表面的干燥，随后5% C02、37°C孵箱中培养2d，每24h换液一次；
3、2d后，更换成构建培养液SKc3，并进行气液面培养，在5%C02、37°C孵箱中培养2d，每24h换液一次；
4、2d后，更换成构建培养液SKc4，并进行气液面培养，在5%C02、37°C孵箱中培养Id 不同构建用液的所含成分具体如下:
构建基础培养基为DMEM
构建培养液SKcl是在DMEM培养液中添加体积比为10%的胎牛血清(FBS)，0.2 ng/ml的 EGF，0.2 μ g/ml 的地塞米松，20 μ g/L 的胰岛素(INSULIN)，15 μ g/ml 的腺嘌呤，0.15nM的 Thyroxine (T3)，9 yg/ml 维甲酸；
培养液SKc2是在DMEM培养液中添加体积比分别为10%的胎牛血清(FBS)，添加0.25mM 的 CaC12，0.2 ng/ml 的 EGF，45 μ g/ml 的 Vc，0.2 μ g/ml 的地塞米松，20 μ g/L 的胰岛素(INSULIN), 15 μ g/ml 的腺嘌呤，0.15nM 的 Thyroxine (T3)，4 μ g/ml 维甲酸； 构建培养液SKc3是在DMEM培养液中添加体积比分别为10%的胎牛血清(FBS)，添加
0.5mM 的 CaC12，0.2 ng/ml 的 EGF，45 μ g/ml 的 Vc，0.2 μ g/ml 的地塞米松，10 μ g/L 的胰岛素(INSULIN), 15 μ g/ml 的腺嘌呤，0.15nM 的 Thyroxine (T3)，4 μ g/ml 维甲酸；
构建培养液SKc4是在DMEM培养液中添加体积比分别为10%的胎牛血清(FBS)，添加ImM 的 CaC12，0.25 ng/ml 的 EGF，0.2 μ g/ml 的地塞米松，10 μ g/L 的胰岛素(INSULIN)，40 μ g/ml 的腺嘌呤，0.15ηΜ 的 Thyroxine (T3), 4 μ g/ml 维甲酸。
[0027]实施例3:
步骤一、脂肪层的构建
1、P6代脂肪间充质干细胞消化后，800rpm/min条件下离心5min。体积比为10%胎牛血清(FBS)的α-ΜΕΜ培养基中重悬，每孔0.2Ε6密度接种至Transwell小室，小室内液量150 μ 1,5% C02、37°C孵箱中培养；
2、24h后小室内液体更换为成脂诱导液，保持小室内液量150μ 1，5% C02、37°C孵箱中培养6d，每隔2d换液；
3、6d后，重复步骤1，24h后更换小室内外培养液为成脂诱导液，5%C02、37°C孵箱中培养2d，每24h更换小室内液体，加液量同上。
[0028]成脂诱导液组成:a -MEM培养基作为基础液，其中添加体积比为10%的胎牛血清(FBS)，吲哚美辛 0.04mg/ml，IBMX 0.2mg/ml，胰岛素 0.01 mg/ml，地塞米松 0.8 μ g/ml。
[0029]步骤二、真皮层的构建:
UPlO代成纤维细胞经消化后，于800rpm/min条件下离心5min。在含有25 μ g/ml Vc以及体积比为10%的胎牛血清(FBS)的a -MEM培养基中重悬，以每孔0.25Ε6密度接种至步骤一的脂肪层，保证小室内液量150 μ 1,5% C02、37°C孵箱中培养；
2、24h后，重复步骤1，在5% C02、37°C孵箱中培养2d，每隔24h换液。
[0030]步骤三、表皮层的构建:
1、P8代表皮细胞培养融合率达70%左右时，进行消化，于800rpm/min条件下离心6min，构建培养液SKcl重悬，以3.0E5/孔的细胞密度接种至步骤二的真皮层中。其中，SKcl阶段为液下培养方式，保证小室内液量150 μ 1，于5% C02、37°C孵箱中培养，每24h换液一次；
2、培养2d后，更换成构建培养液SKc2培养液，并进行气液面培养，将步骤I中Transwell小室的培养液吸去，保持人工皮肤表面的干燥，随后5% C02、37°C孵箱中培养2d，每24h换液一次；
3、3d后，更换成构建培养液SKc3，并进行气液面培养，5%C02、37°C孵箱中培养3d，每24h换液一次；
4、3d后，更换成构建培养液SKc4，并进行气液面培养，5%C02、37°C孵箱中培养2d，每24h换液一次；
不同构建用液的所含成分具体如下:
构建基础培养基为DMEM
构建培养液SKcl是在DMEM培养液中添加体积比分别为10%的胎牛血清(FBS)，0.25ng/ml的EGF，0.8 μ g/ml的地塞米松，5 μ g/L的胰岛素(INSULIN), 25 μ g/ml的腺嘌呤，
0.25nM 的 Thyroxine (T3)，10 μ g/ml 维甲酸； 培养液SKc2是在DMEM培养液中添加体积比分别为10%的胎牛血清(FBS)，添加0.25mM 的 CaC12，0.25 ng/ml 的 EGF，45 μ g/ml 的 Vc，0.8 μ g/ml 的地塞米松，20 μ g/L 的胰岛素(INSULIN)，25 μ g/ml 的腺嘌呤，0.25nM 的 Thyroxine (T3)，10 μ g/ml 维甲酸；
构建培养液SKc3是在DMEM培养液中添加体积比分别为10%的胎牛血清(FBS)，添加
0.5mM 的 CaC12，0.25 ng/ml 的 EGF，45 μ g/ml 的 Vc，0.25 μ g/ml 的地塞米松，20 μ g/L 的胰岛素(INSULIN)，25 μ g/ml 的腺嘌呤，0.25nM 的 Thyroxine (T3)，10 μ g/ml 维甲酸；
构建培养液SKc4是在DMEM培养液中添加体积比分别为10%的胎牛血清(FBS)，添加ImM 的 CaC12，0.25 ng/ml 的 EGF，0.25 μ g/ml 的