地塞米松，5 μ g/L 的胰岛素(INSULIN)，40 μ g/ml 的腺嘌呤，0.25nM 的 Thyroxine (T3)，10 μ g/ml 维甲酸。
[0031]实施例4:
步骤一、脂肪层的构建
1、P6代的脂肪间充质干细胞经消化，于800rpm/min条件下离心5min。用含体积比10%胎牛血清(FBS)的a -MEM培养基中重悬，每孔0.25Ε6密度接种至Transwell小室，小室内液量150 μ 1,5% CO2、37 °C孵箱中培养；
2、24h后更换培养液，弃去小室内外的a-MEM培养基，加入成脂诱导液，保持小室内液量150 μ 1，5% C02、37°C孵箱中培养5d，每隔2d换液；
3、5d后，重复步骤l，24h后更换小室内外培养液为成脂诱导液，保持小室内液量150 μ 1,5% C02、37°C孵箱中培养4d，每隔24h更换小室内液体，加液量同上。
[0032]成脂诱导液组成:a -MEM培养基作为基础液，其中添加体积比为10%的胎牛血清(FBS)，吲哚美辛 0.05mg/ml，IBMX 0.2mg/ml，胰岛素 0.02 mg/ml，地塞米松 0.1 μ g/ml。
[0033]步骤二、真皮层的构建:
1、P6代成纤维细胞消化后，于800rpm/min条件下离心5min。在含有35μ g/ml Vc以及体积比为10%的胎牛血清(FBS)的a -MEM培养基中重悬，以每孔0.25Ε6密度接种至步骤一的脂肪层，保证小室内液量150 μ 1,5% C02、37°C孵箱中培养；
2、24h后，重复步骤1，在5%C02、37°C孵箱中培养2d，每隔24h换液，保证小室内液量150 μ 10
[0034]步骤三、表皮层的构建:
1、Ρ5代表皮细胞培养融合率达60%左右，消化后于800rpm/min条件下离心8min，用构建培养液SKcl重悬，以3.0E5/孔的细胞密度接种至步骤二的真皮层中。其中，SKcl阶段为液下培养方式，保证小室内液量150 μ 1，于5% C02、37°C孵箱中培养，每24h换液一次；
2、培养3d后，更换成构建培养液SKc2培养液，并进行气液面培养，将步骤I中Transwell小室的培养液吸去，保持人工皮肤表面的干燥，随后5% C02、37°C孵箱中培养3d，每24h换液一次；
3、3d后，更换成构建培养液SKc3，并进行气液面培养，5%C02、37°C孵箱中培养3d，每24h换液一次；
4、3d后，更换成构建培养液SKc4，并进行气液面培养，5%C02、37°C孵箱中培养2d，每24h换液一次；
不同构建用液的所含成分具体如下:
构建基础培养基为DMEM 构建培养液SKcl是在DMEM培养液中添加体积比分别为10%的胎牛血清(FBS)，0.5ng/ml 的 EGF，0.25 μ g/ml 的地塞米松，15 μ g/L 的胰岛素(INSULIN)，25 μ g/ml 的腺嘌呤，0.1nM 的 Thyroxine (T3)，10 μ g/ml 维甲酸；
构建培养液SKc2是在DMEM培养液中添加体积比分别为10%的胎牛血清(FBS)，添加0.25 mM 的 CaC12，0.5 ng/ml 的 EGF，55 μ g/ml 的 Vc，0.25 μ g/ml 的地塞米松，15 μ g/L的胰岛素(INSULIN)，25 μ g/ml 的腺嘌呤，0.1nM 的 Thyroxine (T3)，10 μ g/ml 维甲酸；构建培养液SKc3是在DMEM培养液中添加体积比分别为10%的胎牛血清(FBS)，添加0.5mM 的 CaC12，0.5 ng/ml 的 EGF，55 μ g/ml 的 Vc，0.25 μ g/ml 的地塞米松，15 μ g/L 的胰岛素(INSULIN)，40 μ g/ml 的腺嘌呤，0.2nM 的 Thyroxine (T3)，10 μ g/ml 维甲酸；培养液SKc4是在DMEM培养液中添加体积比为10%的胎牛血清(FBS)，添加ImM的CaC12，0.5ng/ml 的 EGF，0.25 μ g/ml 的地塞米松，15 μ g/L 的胰岛素(INSULIN)，40 μ g/ml 的腺嘌呤，0.2nM 的 Thyroxine (T3)，10 μ g/ml 维甲酸。
[0035]由此，不难看出，以上各实施例所提供的用于体外替代测试的全层皮肤是含有脂肪层的人工皮肤，具有三层皮肤结构，自上而下分别为表皮层，真皮层，脂肪层。表皮层由表皮细胞生发复层化组成，厚度约为150?200Mm ;真皮层由成纤维细胞及其胞外基质组成，厚度约40.0?60.0Mffl ;脂肪层由脂肪间充质干细胞经诱导而成的脂肪细胞及胞外基质组成，厚度约为10.0?20.0Mm。其中，表皮层通过表皮细胞在特殊的气液面培养条件下(即以上各实施例所述的培养方式)生发成类似正常人体皮肤的表皮样结构；真皮层构建时不添加任何外源支架结构，通过多次细胞接种法分泌大量细胞外基质，构成厚度约40.0?60.0Mffl的真皮层厚度，除保证同人体正常皮肤结构的高度相似，还可满足表皮层生发时所需营养；脂肪层是在三维培养条件下，将脂肪间充质干细胞经过成脂诱导液培养，使之诱导分化为可形成脂滴的脂肪细胞，同时细胞通过增殖及胞外基质分泌作用复层化形成。
[0036]而以上各实施例提供的用于体外替代测试的全层皮肤的制备过程具体通过以下步骤体现:
步骤一、脂肪层的构建
1.1)、将P3?P8代的脂肪间充质干细胞消化后，于800?1000 rpm/min条件下离心5?8min。在含体积比为5?10%的胎牛血清(FBS)的a -MEM培养基中重悬，以每孔0.12Ε6?0.25Ε6密度接种至Transwell小室，保持小室内液量150?200 μ 1，在4.5%?
5.5% C02、37±1°C的孵箱中培养；
1.2)、18?24h后更换培养液，弃去小室内外的a -MEM培养基，加入成脂诱导液，保持小室内液量150?200 μ 1，在4.5%-5.5% C02、37± 1°C的孵箱中培养5?7d，每隔2?3d换液；
1.3)、5?7d后，重复步骤1.1)、，18?24h后更换小室内外培养液为成脂诱导液，保持小室内液量150?200 μ 1，在4.5%?5.5% C02、37± 1°C的孵箱中培养2?4d，每隔18?24h更换小室内液体，加液量同上；
成脂诱导液组成:a -MEM培养基作为基础液，其中添加体积比为5?10%的胎牛血清(FBS)，吲哚美辛 0.01 ?0.05mg/ml，ΙΒΜΧ0.1 ?0.5mg/ml，胰岛素 0.01 ?0.05 mg/ml，地塞米松 0.1 ~ 0.8 μ g/ml O
[0037]本步骤一是构建含脂肪层的全层皮肤的关键步骤。本步骤采用从脂肪组织中提取的脂肪间充质干细胞作为脂肪层的种子细胞。脂肪间充质干细胞首先易获取且不易造成继发缺损或者感染。从整形美容外科患者的腹部、上臂、大腿、臀部等部位抽出的脂肪组织均可分离；其次，从以上方式获得的脂肪组织数量较大，可分离大量的脂肪间充质干细胞；最后，脂肪间充质干细胞在脂肪诱导培养液的诱导作用下同其它来源的间充质干细胞相比具有更高的分化率。在上述步骤中，采用脂肪层的两次接种，这样处理的优势是保证在短期培养过程中脂肪层具有一定的结构性，即能够达到10.0?20.0Mffl厚度；其次首次接种细胞后，通过成脂诱导液的培养，脂肪间充质干细胞开始向脂肪细胞分化并形成脂滴结构。
[0038]脂滴(Lipid Droplet)是脂肪细胞的主要成分，占据了脂肪细胞的大部分空间，月旨滴不仅是脂肪结构性的指证，也是脂肪细胞具有功能性的标志。因此被认为是脂肪细胞诱导分化成功的指标。在出现脂滴结构后进行第二次脂肪间充质干细胞的接种，底层出现脂肪细胞的脂肪层所形成的微环境能够加速二次接种细胞向脂肪细胞的分化，因此在短时间内可形成含有大量脂滴的脂肪层。
[0039]步骤二、真皮层的构建:
2.1)、P6?PlO代成纤维细胞消化后，于800?1000 rpm/min条件下离心5?8min。在含有25?75 μ g/ml Vc以及体积比为5?10%的胎牛血清(FBS)的a -MEM培养基中重悬，以每孔0.12Ε6?0.25Ε6密度接种至步骤一的脂肪层，保证小室内液量150?200 μ 1，
4.5% ?5.5% C02、37±1°C孵箱中培养；
2.2)、18?24h后，重复步骤2.1)、，在4.5%?5.5% C02、37± 1°C孵箱中培养2?4d，每隔18?24h换液，保证小室内液量150?200 μ I。
[0040]步骤二实现了真皮层无外源性支架的构建，通过成纤维细胞自分泌作用获得胞外基质，形成真皮层骨架结构。
[0041]2013年，国外学者David Janson只接种一次成纤维细胞，经过3周培养形成真皮层结构，此过程培养周期长，且培养要求较高。
[0042]因此使用真皮层成纤维细胞的两次接种法，一方面人工缩短真皮层构建周期，快速构建真皮层结构，另一方面避免真皮层长时间培养时因胞外基质分泌，细胞受到机械牵拉所带来的收缩问题。在培养过程中添加一定浓度的Vc，刺激成纤维细胞对胞外基质的分泌，促进真皮层结构形成。
[0043]步骤三、表皮层的构建:
3.1)、P4?P8代表皮细胞培养融合率达60?70%左右时，于800?1000 rpm/min条件下离心6?8min，用构建培养液SKcl重悬，以1.5?3.0E5/孔的细胞密度接种至步骤二的真皮层中。其中，SKcl阶段为液下培养方式，保证小室内液量150?200 μ 1，于4.5%?
5.5% C02、37±1°C孵箱中培养，每18?24h换液一次；
3.2)、培养2?3d后，更换成构建培养液SKc2，并进行气液面培养，将步骤I中Transwell小室的培养液吸去，保持人工皮肤表面的干燥，随后于4.5%?5.5% C02、37±1°C的孵箱中培养2?3d，每18?24h换液一次；
3.3)、2?3d后，更换成SKc3构建培养液，并进行气液面培养，在4.5%?5.5% CO2,37±1°C的孵箱中培养2?3d，每18?24h换液一次；
3.4)、2?3d后，更换成SKc4构建培养液，并进行气液面培养，在4.5%?5.5% CO2,37±1°C的孵箱中培养I?2d，每18?24h换液一次； 不同构建用液的所含成分具体如下:
构建基础培养基为DMEM，
培养液SKcl是在DMEM培养液中添加体积比为5?10%的胎牛血清(FBS)，0.1?0.5ng/ml 的 EGF，0.1 ?0.8 μ g/ml 的地塞米松，3 ?25 μ g/L 的胰岛素(INSULIN)，15 ?45 μ g/ml 的腺嘌吟，0.1 ?0.5nM 的 Thyroxine (T3)，4 ?10 μ g/ml 的维甲酸。
[0044]培养液SKc2是在DMEM培养液中添加体积比为5?10%的胎牛血清(FBS)，添加0.25 ?0.5 mM 的 CaC12，0.1 ?0.5 ng/ml 的 EGF，25 ?75 μ g/ml 的 Vc，0.1 ?0.8 μ g/ml的地塞米松，3?25 μ g/L的胰