岛素(INSULIN)，15?45 μ g/ml的腺嘌呤，0.1?0.5nM的 Thyroxine (T3)，4 ?10 μ g/ml 的维甲酸。
[0045]培养液SKc3是在DMEM培养液中添加体积比为5?10%的胎牛血清(FBS)，添加
0.5 ?ImM 的 CaC12，0.1 ?0.5 ng/ml 的 EGF，25 ?75 μ g/ml 的 Vc，0.1 ?0.8 μ g/ml 的地塞米松，3?25 μ g/L的胰岛素(INSULIN)，15?45 μ g/ml的腺嘌呤，0.1?0.5nM的Thyroxine (T3)，4 ?10 μ g/ml 的维甲酸。
[0046]培养液SKc4是在DMEM培养液中添加体积比为5?10%的胎牛血清(FBS)，添加I ?1.5mM 的 CaC12，0.1 ?0.5 ng/ml 的 EGF，0.1 ?0.8 μ g/ml 的地塞米松，3 ?25 μ g/L 的胰岛素(INSULIN)，15 ?45 μ g/ml 的腺嘌呤，0.1 ?0.5nM 的 Thyroxine (T3)，4 ?10 μ g/ml的维甲酸。
[0047]步骤三通过不同培养体系对人工皮肤的培养，实现表皮细胞在脂肪层、真皮层上的正常生发。本发明培养体系中EGF、维甲酸、地塞米松、Thyroxine、CaC12等因子采用分段、脉冲式添加法，供应表皮细胞生发过程中各个阶段所需营养。
[0048]该含脂肪层的全层皮肤制备方法简单，生产周期短，原料易于获取，可实现大规模产业化生产。所制备的人工皮肤同正常人体皮肤结构相似，并具备一定功能性，构建全程不含有外源支架材料，通过细胞自分泌功能形成皮肤支架，维持皮肤各层细胞生长的微环境，在体外条件下其功能和活性维持时间长，能够满足生物学检测的需求。
[0049]该含脂肪层的全层皮肤具有三层结构，由脂肪层、真皮层、表皮层三层结构复合而成。脂肪层以间充质干细胞为种子细胞，原料获取容易，获取量大，能够满足产业化的生产需求。
[0050]该用于体外替代测试的全层皮肤的制备方法利用脂肪层分次接种法使脂肪层短期培养便能够具有一定结构性，诱导培养基含有的IBMX、胰岛素及地塞米松等因子能够诱导脂肪间充质干细胞向脂肪细胞的分化，当首次接种的脂肪间充质干细胞出现脂滴结构后进行第二次的细胞接种。
[0051]这样做的优势是底层出现脂肪细胞的脂肪层能够诱导具有分化潜能的间充质干细胞向脂肪细胞分化，因此在诱导培养基以及底层脂肪层所形成的微环境下，共同加速二次接种细胞向脂肪细胞的分化速度，短时间内形成含有大量脂滴的具备功能性的脂肪细胞。解决了含脂肪层的人工皮肤分化周期长，功能性不完整的缺陷。
[0052]以成纤维细胞为种子细胞的真皮层多次接种法，解决了真皮层外源支架的引入、培养周期长、真皮层易收缩的缺点。
[0053]利用成纤维细胞自分泌胞外基质的生物学特性，同时添加含有VC的培养基，提高其分泌胞外基质的能力。
[0054]由于是利用细胞自身分泌功能所形成的真皮层，更符合活体皮肤功能和结构。2009年，Abdoelwaheb El Ghalbzouri等人发现含有胶原的真皮层同依靠细胞自分泌功能形成真皮层的人工皮肤相比，后者在体外的维持时间是前者的2?3倍，含有胶原的真皮层结构更易降解。
[0055]除此之外，无外源支架结构的真皮层中，细胞同细胞之间联系更加紧密，有利于细胞信号的传导，对各种刺激物的响应也更接近于正常人体皮肤组织。
[0056]综上，不难看出，该用于体外替代测试的全层皮肤的制备方法模拟了正常生理条件下皮肤组织的结构及功能，在人体皮肤相关的生物学检测中，检测数据更准确。
[0057]正常人体皮肤的表皮层从下至上可分为:基底层、棘层、颗粒层和角质层。表皮生发的不同阶段所需要营养也不尽相同，该用于体外替代测试的全层皮肤的制备的全层皮肤的表皮层培养过程中根据表皮生发特点，阶段式或脉冲式添加EGF、维甲酸、地塞米松、Thyroxine、CaCl2、VC等营养因子，保证表皮层正常生发。
[0058]参考文献:
[I].JULIE FRADETTE.1FATS Collect1n: Using Human Adipose-Derived Stem/Stromal Cells for the Product1n of New Skin Substitutes.STEM CELLS2008;26:2713 - 2723。
【主权项】
1.一种用于体外替代测试的全层皮肤模型，其特征在于:具有三层皮肤结构，自上而下分别为表皮层，真皮层和脂肪层； 所述表皮层由表皮细胞生发复层化组成； 所述真皮层由成纤维细胞及其胞外基质组成； 所述脂肪层由脂肪间充质干细胞经诱导而成的脂肪细胞及胞外基质组成。2.如权利要求1所述的用于体外替代测试的全层皮肤模型，其特征在于: 所述表皮层的厚度为150?200Mm ; 所述真皮层的厚度为40.0?60.0Mm ； 所述脂肪层的厚度为10.0?20.0Mm。3.—种权利要求1或2所述用于体外替代测试的全层皮肤模型的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: 步骤一、脂肪层的构建 .1.1)、将P3?P8代的脂肪间充质干细胞消化后，于800?1000 rpm/min条件下离心.5?8min ;在含体积比为5?10%胎牛血清FBS的a -MEM培养基中重悬，以每孔0.12Ε6?.0.25Ε6密度接种至Transwell小室，保持该Transwell小室内的液量为150?200 μ 1，在.4.5%?5.5% C02、37±1°C的孵箱中培养； .1.2)、18?24h后弃去所述Transwell小室内外的a -MEM培养基，加入成脂诱导液，保持所述Transwell小室内液量150?200 μ 1，在4.5%?5.5% C02、37± 1°C的孵箱中培养.5?7d，每隔2?3d换液； . 1.3)、5?7d后，重复步骤1.1)，18?24h后更换所述Transwell小室内外培养液为成脂诱导液，保持所述Transwell小室内液量150?200 μ 1，在4.5%?5.5% C02、37±1°C孵箱中培养2?4d，每隔18?24h更换所述Transwell小室内液体，保持所述Transwell小室内液量150?200 μ I ； 所述成脂诱导液的组成:以a -MEM培养基作为基础液，其中添加体积比分别为5?.10%的胎牛血清FBS,吲哚美辛0.01?0.05mg/ml，ΙΒΜΧ0.1?0.5mg/ml，胰岛素0.01?.0.05 mg/:ml，地塞米松 0.1 ?0.8 μ g/ml ； 步骤二、真皮层的构建: .2.1)、P6?PlO代成纤维细胞消化后，于800?1000 rpm/min条件下离心5?8min ；在含有25?75 μ g/ml Vc以及体积比为5?10%的胎牛血清FBS的a -MEM培养基中重悬，以每孔0.12Ε6?0.25Ε6密度接种至步骤一制备的脂肪层，保证所述Transwell小室内液量150?200 μ 1，在4.5%?5.5% C02、37± 1°C的孵箱中培养； . 2.2)18?24h后，重复步骤2.1)，在4.5%?5.5% C02、37± 1°C的孵箱中培养2?4d，每隔18?24h换液，保证所述Transwell小室内液量150?200 μ I ； 步骤三、表皮层的构建: . 3.1)、待Ρ4?Ρ8代表皮细胞培养融合率达60?70%左右时，于800?1000 rpm/min条件下离心6?8min，用构建培养液SKcl重悬，以1.5?3.0E5/孔的细胞密度接种至步骤二制备的真皮层中；其中，SKcl阶段为液下培养方式，保证所述Transwell小室内液量.150?200 μ 1，于4.5%?5.5% C02、37± 1°C的孵箱中培养，每18?24h换液一次； . 3.2)、培养2?3d后，更换成构建培养液SKc2，并进行气液面培养，将步骤3.1)中Transwell小室的培养液吸去，保持人工皮肤表面的干燥，随后在4.5%?5.5% C02、37±1°C的孵箱中培养2?3d，每18?24h换液一次； . 3.3)、2?3d后，更换成构建培养液SKc3，并进行气液面培养，在4.5%?5.5% CO2,.37±1°C的孵箱中培养2?3d，每18?24h换液一次； .3.4)、2?3d后，更换成构建培养液SKc4，并进行气液面培养，在4.5%?5.5% CO2,.37±1°C的孵箱中培养I?2d，每18?24h换液一次； 不同构建培养液所含成分具体如下: 构建基础培养基为DMEM ； 所述构建培养液SKcl是在DMEM培养液中添加体积比分别为5?10%的胎牛血清FBS，.0.1 ?0.5ng/ml 的 EGF，0.1 ?0.8 μ g/ml 的地塞米松，3 ?25 μ g/L 的胰岛素 INSULIN，.15 ?45 μ g/ml 的腺嘌吟，0.1 ?0.5nM 的 ThyroxineT3, 4 ?10 μ g/ml 的维甲酸； 所述构建培养液SKc2是在DMEM培养液中添加体积比分别为5?10%的胎牛血清FBS，添加 0.25 ?0.5 mM 的 CaCl2,0.1 ?0.5 ng/ml 的 EGF，25 ?75 μ g/ml 的 Vc，0.1 ?0.8μ g/ml的地塞米松，3?25 μ g/L的胰岛素INSULIN，15?45 μ g/ml的腺嘌呤，0.1?0.5nM的ThyroxineT3，4?10 μ g/ml的维甲酸；所述构建培养液SKc3是在DMEM培养液中添加体积比分别为5?10%的胎牛血清FBS，添加0.5?ImM的CaCl2,0.1?0.5 ng/ml的EGF，25 ?75 μ g/ml 的 Vc，0.1 ?0.8 μ g/ml 的地塞米松，3 ?25 μ g/L 的胰岛素 INSULIN，.15?45 μ g/ml的腺嘌吟，0.1?0.5nM的ThyroxineT3，4?10 μ g/ml的维甲酸；所述构建培养液SKc4是在DMEM培养液中添加体积比分别为5?10%的胎牛血清FBS，添加I?.1.5mM 的 CaCl2,0.1 ?0.5 ng/ml 的 EGF，0.1 ?0.8 μ g/ml 的地塞米松，3 ?25 μ g/L 的膜岛素 INSULIN，15 ?45 μ g/ml 的腺嘌吟，0.1 ?0.5nM 的 ThyroxineT3，4 ?10 μ g/ml 的维甲酸。
【专利摘要】本发明提供的一种用于体外替代测试的全层皮肤模型及其制备方法，该全层皮肤自上而下分别为由表皮细胞生发复层化组成的表皮层，由成纤维细胞及其胞外基质组成的真皮层和由脂肪间充质干细胞经诱导而成的脂肪细胞及胞外基质组成的脂肪层；其制备方法模拟了人体皮肤的生长发育过程，制备周期短，方法简易，可控性强，原料易于获取，可实现大规模产业化生产，并且构建全程不使用外源支架材料，通过细胞自分泌细胞外基质形成皮肤支架，维持皮肤各层细胞生长的微环境，制备的含脂肪层全层皮肤更接近于正常人体皮肤结构，并具备相应的功能性，在体外条件下其功能和活性维持时间，能够满足相关皮肤生物学检测的需求。
【IPC分类】C12N5/071
【公开号】CN105087464
【申请号】CN201510503781
【发明人】孙蓓, 卢永波
【申请人】陕西博溪生物科技有限公司
【公开日】2015年11月25日
【申请日】2015年8月17日