中的标准拷贝数或另外预定的标准水平来进行，其中所述数量的改变 预示改变的肾状态。
[0110] 在一个实施方案中，来自正常群体的尿样中的染色体的标准拷贝数通过测定正常 群体中该特定染色体的平均拷贝数来测定。在一个实施方案中，来自正常群体的尿样中的 染色体的标准拷贝数通过测定正常群体中该特定染色体的拷贝数中位值来测定。在一个实 施方案中，来自正常群体的尿样中的染色体的标准拷贝数通过测定正常群体中该特定染色 体的拷贝数范围来测定。
[0111] 在一个实施方案中，来自正常群体的尿样中的染色体1的标准拷贝数通过测定正 常群体中染色体1的平均拷贝数来测定。一个实施方案中，来自正常群体的尿样中的染色 体1的标准拷贝数通过测定正常群体中染色体1的拷贝数中位值来测定。在一个实施方案 中，来自正常群体的尿样中的染色体1的标准拷贝数通过测定正常群体中染色体1的拷贝 数范围来测定。
[0112] 在一个实施方案中，来自正常群体的尿样中的ALU重复单元的标准数量通过测定 正常群体中ALU基因座的重复单元的平均数量来测定。在一个实施方案中，来自正常群体 的尿样中的染色体1的标准拷贝数通过测定正常群体中ALU基因座的重复单元的中位值来 测定。在一个实施方案中，来自正常群体的尿样中的ALU重复单元的标准数量通过测定正 常群体中ALU重复单元的数量范围来测定。
[0113] 在一个实施方案中，正常群体是未患有或始终未患有肾损伤、肾病、肾移植物损伤 或肾移植物排斥的个体人群。在另一个实施方案中，正常群体是个体人群，其拷贝数在患有 肾损伤、肾病、肾移植物损伤或肾移植物排斥之前测定。在另一个实施方案中，正常群体是 患有肾损伤、肾病、肾移植物损伤或肾移植物排斥、但尚未恢复的个体人群。在不同的实施 方案中，正常群体是年龄匹配、性配对、病史匹配（例如糖尿病、心血管疾病、高血压、在先 病毒感染、肾癌等）、血型匹配、种族来源匹配、种族性匹配、移植史匹配、可以导致用于正常 群体的测量值不均匀性的任意群体变量匹配及其组合的个体人群。
[0114] 在一个实施方案中，如来自样品测定的数量等于或基本上与来自正常群体的尿样 中的拷贝数相同或另外预定的标准水平。在另一个实施方案中，如来自样品测定的数量低 于来自正常群体的尿样中的拷贝数相同或另外预定的标准水平。在另一个实施方案中，如 来自样品测定的数量高于来自正常群体的尿样中的拷贝数相同或另外预定的水平。在一 个相关的实施方案中，如来自样品测定的数量高于来自正常群体的尿样中的拷贝数或另外 预定标准水平的至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少 15、至少20、至少25、至少50、至少75、至少100、至少250、至少500、至少750、至少1000、至 少2500、至少5000、至少7500、至少10, 000、至少50, 000、至少100, 000、至少500, 000、至少 1，000, 000、至少10, 000, 000或甚至至少100, 000, 000倍。在另一个实施方案中，如来自样 品测定的数量低于来自正常群体的尿样中的拷贝数相同或另外预定的标准水平。
[0115] 试剂盒
[0116] 本发明还提供了包含用于执行本发明诊断和预后方法的材料的试剂盒。可以通过 临床实验室、实验室或医师执行本文所述的操作。本发明提供可以用于这些不同环境的试 剂盒。
[0117] 在一个实施方案中，本发明的试剂盒包含至少一种用于定量如本文所述的至少一 种染色体的拷贝数的引物组。在一些实施方案中，所述试剂盒包含至少一种引物组，其用于 定量存在于得自个体的样品中的任意染色体的拷贝数或更具体地定量任意常染色体的拷 贝数、染色体1的拷贝数、染色体Y的拷贝数或ALU重复单元的数量。在一个实施方案中， 所述样品得自所述个体。优选提供引物组，其用量适合于检测尿样中的cfDNA。
[0118] 在一个实施方案中，本发明的试剂盒包含用于定量来自尿样的cfDNA中的任意常 染色体的拷贝数的引物组。在另一个实施方案中，设计引物组以便靶向通过该群体相对恒 定的染色体基因座。在另一个实施方案中，设计引物组以便靶向代表恒定区的染色体或染 色体的部分的基因座。在另一个实施方案中，设计引物组以便靶向染色体的非可变区或非 高变区。在另一个实施方案中，设计引物组以便靶向通过该群体非恒定的染色体的基因座。 在另一个实施方案中，设计引物组以便靶向代表可变区的染色体或染色体部分的基因座。 在另一个实施方案中，设计引物组以便靶向染色体的高变区。本领域技术人员使用目前可 利用的基因组方法和数据库能够鉴定为恒定的、非恒定的、可变的、非可变的、高变的、非高 变的等的那些染色体或基因的基因座区域。
[0119] 在一些实施方案中，本发明的试剂盒包含引物组，其用于对提取自得自如上所述 个体的尿样的cfDNA中的ALU重复单元的数量进行定量。
[0120] 在一个实施方案中，所述引物组能够扩增ALU基因座的115个碱基对扩增子。在 该实施方案中，所述引物组可以包含正向引物5'-GCCTGTAATCCCAGCTACTC-3'和反向引物 5' -ATCTCGGCTCACTGCAAC-3'。在一个具体的实施方案中，该引物组能够用于数字PCR，且该 引物组还包含用于数字PCR的探针。这种探针的一个示例性序列是5' -HEXTCAAGCGATTCTC CTGCCTCAGC-BHQ-3, 。
[0121] 在另一个实施方案中，所述引物组能够扩增ALU基因座的另一种扩增子。在该 实施方案中，所述引物组可以包含正向引物5' -GGAGGCTGAGGCAGGAGAA-3'和反向引物 5' -ATCTCGGCTCACTGCAACCT-3'。在一个具体的实施方案中该引物组能够用于数字PCR，且该 引物组还包含用于数字PCR的探针。这种探针的一个示例性序列是
[0122] 5' （FAM)CGCCTCCCGGGTTCAAGCG-3' 。
[0123] 在一些实施方案中，本发明的试剂盒包含用于定量染色体1、染色体2、染色体3、 染色体4、染色体5、染色体6、染色体7、染色体8、染色体9、染色体10、染色体11、染色体12、 染色体13、染色体14、染色体15、染色体16、染色体17、染色体18、染色体19、染色体20、染 色体21和/或染色体22的拷贝数的引物组，所述染色体在提取自得自如本文所述的个体 的尿样的cfDNA中。
[0124] 在一些实施方案中，本发明的试剂盒包含用于对提取自得自如上所述个体的 尿样的cfDNA中的染色体1的拷贝数定量的引物组。在一个实施方案中，所述引物组 能够扩增基因座EIF2C1的扩增子。在该实施方案中，所述引物组可以包含正向引物 5'-GITCGGCTITCACCAGTCT和反向引物 5' -CTCCATAGCTCTCCCACTC。在一个实施方案中，所述 引物组能够用于数字PCR，且该引物组还包含用于数字PCR的探针。用于这种探针的一个示 例性序列是 5' -HEX-CGCCCTGCCATGTGGAAGAT-BHQ1。
[0125] 在一些实施方案中，本发明的试剂盒包含用于对提取自得自如上所述个体的 尿样的cfDNA中的染色体Y的拷贝数定量的引物组。在一个实施方案中，所述引物组 能够扩增基因座DYS 14的扩增子。在该实施方案中，所述引物组可以包含正向引物 5' -ATCGTCCAITTCCAGAATCA 和反向引物 5' -gttgacagccgtggaatc。在一个实施方案中，所 述引物组能够用于数字PCR，且该引物组还包含用于数字PCR的探针。用于这种探针的一 个示例性序列是5' -FAM-TGCCACAGACTGAACTGAATGATTTTC-BHQ1。在另一个实施方案中，所 述引物组能够扩增因座SRY的扩增子。在该实施方案中，所述引物组可以包含正向引物 5' -CGCTTAACATAGCAGAAGCA 和反向引物 5' -AGITTCGAACTCTGGCACCT。在一个实施方案中，所 述引物组能够用于数字PCR，且该引物组还包含用于数字PCR的探针。用于这种探针的一个 示例性序列是 5' -FAM-TGTCGCACTCTCCTTGTITITGACA-BHQ1。
[0126] 在一些实施方案中，本发明的试剂盒包含用于对提取自得自如上所述个体的尿样 的cfDNA中的染色体X的拷贝数定量的引物组。
[0127] 在一些实施方案中，本发明的试剂盒包含一种或多种引物，其可以倍固定在底物 表面上（例如，珠、阵列等）。
[0128] 正如可接受的，这些内容启示试剂盒成分可以由本领域技术人员以常用的方式包 装。例如，这些内容启示可以将试剂盒成分以溶液形式提供或作为液体分散体提供等。包 括在本发明试剂盒中的不同的试剂可以以固体（例如，冻干的）或液体形式提供。本发明 的试剂盒还可以包含用于各种缓冲液和/或试剂的不同的容器（例如，小瓶、安瓿、试管、烧 瓶或瓶子）。每种成分一般适合于作为等分在其相应的容器中或以浓缩形式被提供。还可 以提供适合于进行所公开的方法的一些步骤的其它容器。优选将试剂盒的各容器以密闭形 式维持以便商业销售。
[0129] 在一些实施方案中，试剂盒还包含用于根据本发明方法使用其成分诊断个体的肾 状态、肾移植物状态、肾病、肾损伤或肾移植物排斥的说明书。根据本发明方法的试剂盒的 使用说明书可以包含用于处理得自所述个体的生物样品的说明书和/或进行试验和/或解 释结果的说明书。
[0130] 试剂盒还可以包含由管理药物或生物产品制造、使用或销售的政府部门开据的表 格形式的通告。
[0131] 计筧机稈序
[0132] 可以使用包含记录在计算机可读媒体上的计算机执行逻辑形式的计算机程序产 品执行上述方法的任一种。例如，计算机程序可以执行如下功能的一些或全部：（i)控制核 酸从样品中分离；（ii)预先由样品扩增核酸；（iii)扩增样品中的特定区；（iv)鉴定和定 量样品中的总cfDNA、染色体拷贝数或ALU重复单元数量；（V)比较如从样品与参比标准品 中检测的数据；(vi)测定肾状态或临床结果；(vi)说明正常或异常肾状态或临床结果。
[0133] 计算机可执行逻辑形式可以在任何计算机中工作，所述计算机可以是任一种类型 的通用计算机，例如个人计算机、网络服务器、工作站或其它目前或随后研发的计算机平 台。在一些实施方案中，描述了计算机程序产品，其包含具有其中储存的计算机执行逻辑形 式（计算机软件程序，包括程序代码的计算机可读媒体。可以由处理器执行计算机可执行 逻辑形式，导致处理器执行本文所述的功能。在其它实施方案中，一些功能主要使用例如硬 件状态机在硬件中执行。硬件状态机的执行以便执行本文所述的功能对于本领域技术人员 而言显而易见。
[0134] 所述程序可以提供评价处于发生肾病、肾损伤、肾移植损伤或肾移植排斥风险中 或患有它们的个体的肾状态或临床结果的方法。 实施例
[0135] 实施例1 :通讨测宙染色体Y和染色体1拷贝数检测血浆中的无细朐DNA
[0136] 对来自10位具有或不具有急性排斥（AR)发作的肾移植患者的33份唯一的血浆 样品进行染色体Y和染色体1拷贝数定量。3位患者是男性肾的女性接受者。另外7位患 者具有其他性别的组合。10位患者中的9位经活组织检查证实损伤。对于每位患者，分析 2-4份连续的血浆样品。
[0137] 使用QIAamp循环核酸试剂盒（Qiagen)、按照制造商的说明纯化和浓缩来自3mL血 衆的循环cfDNA。然后使用Quant-iT? PicoGreen dsDNA试剂和试剂盒（Invitrogen)、按 照制造商的说明定量总DNA。
[0138] 数字PCR用于测定染色体Y和染色体1的拷贝数。使用如下引物和探针 制备具有Rox(Roche)的FastStartTaqManProbeMasterMix。为 了扩增染色体Y上基因座DYS14(多拷贝基因座）的84个碱基对的扩增子，使用如下：正向引物 5'-ATCGTCCAITTCCAGAATCA;反向引物 5'-gttgacagccgtggaatc;和探针 5' -FAM-TGCCACAGA CTGAACTGAATGATTTTC-BHQ1。
[0139] 为了扩增染色体1上基因座EIF2C1的81个碱基对的扩增子，使用如 下：正向引物 5' -GITCGGCTITCACCAGTCT ;反向引物 5' -CTCCATAGCTCTCCCACTC ;探针 HEX-CGCCCTGCCATGTGGAAGAT-BHQ1。
[0140] 使用BioMark实时PCR系统（Fluidigm)将样品负载在12. 765数字阵列芯片 上。使用PicoGreen测定样品的总DNA含量以确保等量负荷。对照男性和女性基因组 DNA(Promega)用于校准染色体1和染色体Y信号。
[0141] 使用数字PCR分析软件v3. 0提取和评估数据。使用如下等式计算每种染色体的 拷贝数：
[0142] (382/组/4. 59y1/组）X(8y1反应混合物/IyI DNA)=原始样品中的拷贝数/ y 1〇
[0143] 为了评价血浆样品中染色体1的拷贝数是否染色体Y的与拷贝数相关，分析来自4 位男性肾的女性接受者患者的13份血浆样品（其中3位患者经活组织检查证实移植物损 伤）。
[0144] 图1呈现来自进行肾移植、具有或不具有急性排斥（AR)发作的个体的血浆样品中 染色体1染色体Y的拷贝数之间的相关性。在血浆中，使用定向于多基因座基因的DYS-14 引物检测到染色体Y。当与测定来自尿的cfDNA比较时，作为通过测定来自血浆的cfDNA检 测肾损伤的测量值的染色体1的无细胞拷贝数的灵敏度仅有33%的灵敏度。
[0145] 这些数据显示血浆在测定cfDNA以监测肾损伤方面是低于最佳的体液。
[0146] 实施例2 :通讨测宙染色体Y和染色体1拷贝数检测尿中的无细朐DNA
[0147] 对来自40位具有或不具有急性排斥（AR)发作的肾移植患者的125份唯一的尿样 进行染色体Y和染色体1拷贝数定量。在125份样品中，20份取自具有AR发作或处于AR 发作边缘的个体且105份样品取自尚未AR发作的个体。125份尿样中的53份来自16位 男性肾的女性接受者。其余的72份尿样来自24位具有其它性别组合的患者。对于每位患 者，分析2-4份连续样品。通过清洁收集方法得到50-100mL尿。清洁收集方法是一种采 集尿的方法，其中患者用卫生擦拭纸擦拭生殖器，弃去第一部分尿并且随后在排尿过程中 将中流尿采集在无菌杯中。然后以2000xg将样品离心20分钟。从5mL上清液中纯化循环 的cfDNA并且使用QIAamp循环核酸试剂盒（Qiagen)、按照制造商的说明浓缩。然后使用 Quant-iT? PicoGreen dsDNA试剂和试剂盒（Invitrogen)、按照制造商的说明定量总DNA。
[0148] 使用BioMark(Fluidigm)实时PCR系统测定染色体Y和染色体1的拷贝数。使 用如下引物和探针制备具有Rox(Roche)的FastStartTaqManProbeMasterMix。为 了扩增染色体Y上基因座SRY(单一拷贝基因座）的84个碱基对扩增子，使用如下：正向 引物 5'CGCTTAACATAGCAGAAGCA;反向引物 5'-AGITTCGAACTCTGGCACCT;探针 5'FAM-TGTC GCACTCTCCTTGTTTTTGACA-BHQ1。为了扩增染色体1上基因座EIF2C1的81个碱基对扩增 子，使用如下：正向引物 5'-GITCGGCTITCACCAGTCT;反向引物 5'-CTCCATAGCTCTCCCACTC; 探针HEX-CGCCCTGCCATGTGGAAGAT-BHQ1。然后将样品负载在12. 765数字阵列芯片上 (Fluidigm)。如上所述使用PicoGreen测定样品的总DNA含量并且用于确保等量负荷。对