照男性和女性基因组DNA(Promega)用于校准染色体1和染色体Y信号。
[0149] 使用数字PCR分析软件v3. 0提取和评估数据。使用如下等式计算每种染色体的 拷贝数：
[0150] (382/组/4. 59y1/组）X(8y1反应混合物/IyI DNA)=原始样品中的拷贝数/ y 1〇
[0151] 为了评价尿样中染色体1的拷贝数是否与染色体Y的拷贝数相关，图2中比较了 其相应的数量。图2呈现来自12位进行肾移植并且接受男性肾的具有或不具有急性排斥 (AR)发作的女性个体的27份尿样的染色体1染色体Y拷贝数之间的相关性。作为质量 对照且为了评价尿样中染色体1拷贝数的稳定性，测定来自重复试验的3位患者的9份样 品中染色体1的拷贝数。在一式两份试验之间观察到紧密的相关性，正如表1和图3中呈 现的。表1显示在评估的靶标方面两次试验之间的强再现性。'评估的靶标'即一种得自 Fluidigm Biomark仪器的无单位数量。此外，在样品中未检测到染色体Y，其中女性患者接 受来自女性供体的肾移植物。
[0152] 表 1 :
[0154] 接受移植物、但未显示损伤的个体（非移植物损伤表型）的染色体1的平均拷贝 数/mL/尿为1681 ±3124(标准偏差）。接受移植物、但未显示损伤的个体的染色体1的拷 贝数中位值/mL/尿为321。接受移植物、但未显示损伤的个体的染色体1的拷贝数范围/ mL/尿为0-12963个拷贝。
[0155] 接受移植物并且显示损伤的个体（损伤表型）的染色体1的平均拷贝数/mL/尿 为10728±30283 (标准偏差）。接受移植物、但未显示损伤的个体的染色体1的拷贝数中位 值/mL/尿为2009。接受移植物、但未显示损伤的个体的染色体1的拷贝数范围/mL/尿为 0-198496个拷贝。
[0156] 目前用于评价肾状态的标准方法是测定尿蛋白（测定蛋白尿）。为了评价染色 体1拷贝数与尿蛋白测量值的相关性，将尿蛋白与染色体1拷贝数比较。如图4中所示， 尿蛋白的量与染色体1拷贝数充分相关，正如在上述试验中测定的。通过标准Bradford 测定法（考马斯+(Bradford)蛋白测定法，Thermo Scient ific)测定尿蛋白并且使用 QuantiChromTM肌酸酐测定试剂盒（BioAssay Systems)、按照制造商的说明测定尿肌酸酐。
[0157] 尿的无细胞染色体1拷贝数与病理学和临床数据充分相关。这些数据如表2中所 示。染色体1拷贝数与cGFR的相关性优于蛋白尿与cGFR的相关性。类似地，染色体1拷 贝数与急性损伤的相关性优于蛋白尿与急性损伤的相关性。染色体1拷贝数/ y g尿肌酸 酐与急性损伤评分相关：（i)其中r = 0. 32,优于常规蛋白尿与急性损伤评分的相关性，r =0. 22。染色体1拷贝数/ y g尿肌酸酐与cGFR测量值相关，其中r = -0. 28,优于常规蛋 白尿与cGFR的相关性，r = -0. 02。
[0158]表 2：
[0159] 染色体1/肌酸酐
[0161] (P) = P-值，（r)=相关系数，间质⑴、小管⑴和肾小球（g);
[0162] CADI =慢性异体移植物损伤指数（CADI)
[0163] 实施例3 :通讨测宙ALU重复单元数量和ALU重复单元与染色体1拷贝数的相关 件检测尿中的无细朐DNA
[0164] 通过实施例2中所述的尿样中标准实时PCR测定ALU重复单元的数量。对来自40 位具有或不具有急性排斥（AR)发作的肾移植患者的125份唯一的尿样进行ALU重复单元 和染色体1拷贝数定量。在125份样品中，20份取自具有AR发作或处于AR发作边缘的个体 且105份样品取自尚未AR发作的个体。对于每位患者，分析2-4份连续样品。如实施例2 中所述分离和纯化cfDNA。使用Quant-iT? PicoGreen dsDNA试剂和试剂盒（Invitrogen)、 按照制造商的说明定量总DNA。
[0165] 使用BioMark (Fluidigm)实时PCR系统测定染色体Y拷贝数和ALU重复单 元的数量。使用如下引物和探针制备具有Rox(Roche)的FastStart TaqMan Probe Master Mix。为了扩增染色体1上基因座EIF2C1的81个碱基对扩增子，使用如 下：正向引物 5' -GITCGGCTITCACCAGTCT ;反向引物 5' -CTCCATAGCTCTCCCACTC ;探针 HEX-CGCCCTGCCATGTGGAAGAT-BHQ1。为了扩增ALU基因座的115个碱基对扩增子，使用如下： 正向引物 5' -GCCTGTAATCCCAGCTACTC ;反向引物 5' -ATCTCGGCTCACTGCAAC ;探针 5' -HEX-TC AAGCGAITCTCCTGCCTCAGC-BHQ-3'。然后将样品负载在 12. 765 数字阵列芯片上（Fluidigm)。 如上所述使用PicoGreen测定样品的总DNA含量并且用于确保等量负荷。对照男性和女性 基因组DNA(Promega)用于校准染色体1和ALR重复单元信号。
[0166] 使用数字PCR分析软件v3. 0提取和评估数据。使用如下等式计算每种染色体的 拷贝数：
[0167] (382/组/4. 59y1/组）X(8y1反应混合物/IyI DNA)=原始样品中的拷贝数/ y 1〇
[0168] 本实施例证实了使用基因组常染色体DNA在评价肾状态和肾损伤中的应用。图5 显示样品中ALU重复单元与染色体1拷贝数的相关性。将染色体1拷贝数/2ng总DNA与 ALU重复单元的数量/0. 02ng总DNA的关系绘图并且显示染色体1数量与ALU重复单元数 量之间良好的相关性。
[0169] 实施例4 :大规樽研究
[0170] 患者和样品：本研究登记肾移植患者血浆和尿样，这些样品是同时使用所示的肾 异体移植物或活组织检查方案采集的，所述的肾异体移植物或活组织检查方案来自2004 至2010年在Stanford的Lucile Packard儿童医院的儿科和年轻成年人的肾移植物接受 者。本研究中包括这样的患者，其中对于每位选择的患者具有本研究期间的至少2份样品， 具有匹配的移植物活组织检查，包括所有可利用的监测和适应征（异体移植物功能障碍） 来源的尿样。本研究经 Ethics Committee of Stanford University Medical School 和 California Pacific Medical Center Research Institute(CPMCRI)批准并且全部患者/ 监护人提供参与本研究的知情许可，完全符合赫尔辛基宣言（Declaration of Helsinki)。 292份唯一的尿样采集自在移植后3、6、12和24个月的移植后时间点处于监测下和指示的 活组织检查时的75位肾移植患者。血浆样品（n = 40)采集自在移植后3、6和12个月的 时间点处于监测和指示下的12位患者。对于所有参与患者采集未经鉴定的临床信息。由 单一病理学家使用用于急性和慢性损伤的最近期Banff标准以双盲方式给所有匹配的活 检组织评分。按照Banff方案，将急性排斥（AR)定义为最小值，小管炎（tubulitis)评分 多1，附带间质性炎症评分多1。将慢性异体移植物损伤（CAI)定义为最小值，为肾小管萎 缩评分多1，附带间质纤维化评分多1。根据尿和血浆中存在BK病毒和显示炎症和异体移 植物中阳性SV40染色鉴定BK病毒性肾炎（BKVN)。还诊断了急性肾小管坏（ATN)。将肾盂 肾炎定义为存在蛋白尿（pyurina)和细菌性尿道感染和细菌性脓毒症的阳性血液培养物。 将稳定（STA)的异体移植物定义为具有稳定的血清肌酸酐值且不存在有关病理学方面的 显著性损伤的异体移植物。
[0171] 样品采集和处理：将中流尿样（50-100mL)采集在无菌容器中并且在室温在Ih 采集期限内以2000xg离心20min。从包含细胞和细胞碎片的尿沉淀中分离上清液。使 用TrisHCl将上清液的pH调节至7. 0并且储存在-80°C至进一步分析为止。使用Quant ichrom?肌酸酐测定试剂盒（DICT-500) (BioAssay Systems, Hayward, CA)测定尿肌酸酐。 对于每份尿样使用考马斯+Beadford测定试剂盒（Thermo Scientific, Rockford, IL)测定 每份尿样的总蛋白。
[0172] 血样：为了避免用于评价dd-cfDNA的供体和受体DNA测序，使用首先评价20 位女性接受者的模型，然后评价Chr Y cfDNA，其必须通过外推为供体衍生的。在活组 织检查证实为急性排斥时（AR，n = 4)和非AR时（n = 16)采集血样；将非-AR样品 分入急性肾小管坏死（ATN，n = 4)、细菌性脓毒症和肾盂肾炎（pyelon印hrotos) (n = 4)、慢性移植物损伤（CAI ;n = 4)和稳定移植物功能（n = 4)组。将全血采集入肝素 纳试管（BD Biosciences，San Jose, CA)。使用基于Ficoll (Ficoll-Pague PLUS, GE Healthcare，Waukesha，WI)的密度梯度离心分离法除去细胞（淋巴细胞），吸移出血浆级分 并且储存在-800C至使用为止。
[0173] 无细胞DNA提取和定量：使用QIAmp循环核酸试剂盒（Qiagen, Valencia, CA)从 来自在室温完全融化后取出的5ml尿和3ml血浆的尿样和血浆样品中得到cfDNA。如制造 商的方案中所述，首先用蛋白水解酶K(提供的）处理这些样品以便降解细胞碎片并且除 去DNA酶和RNA酶。然后缓冲样品并且加入RNA载体以有助于沉淀cfDNA。使这种裂解物 通过DNA结合柱，且然后用缓冲液（提供的）和100%乙醇洗涤多次，使用50 y 1缓冲液 (提供的）洗脱结合的DNA。包含DNA的洗脱液用于DNA定量和数字PCR(dPCR)。I y 1洗 脱液用于使用 Quant-iT Pico Green 试剂盒（Invitrogen, Carlsbad, CA)、用 IxTE 缓冲液 (提供的）按照1/100的稀释液如制造商的方案所述定量双链cfDNA。将其与等体积的每 个孔（黑色微量滴定板）中的Quant-iT试剂的1/200稀释液合并，使用荧光分光光度计 (Gemini EM, Molecular Devices, Sunnyvale, CA)读取得到的焚光。通过比较10-倍标准曲 线（ADNA,提供的）计算每种样品的浓度（ng/ml)。
[0174] 无细胞DNA测定：使用来自尿的12. 765数字阵列芯片上的5ng提取的 dd-cfDNA、应用 Biomark 实时 PCR 系统（Fluidigm, South San Francisco, CA)进行 数字PCR(dPCR)。如下衍生引物和标记的探针（IDT，Coralville，IA) :1)对于SRY的 每个单一拷贝染色体的基因座（Chr) Y (正向引物：5' CGCTTAACATAGCAGAAGCA ;反向 引物：5'-AGTTTCGAACTCTCTGGCACCT;探针：5'TGTCGCACTCTCCTTGTTmGACA) ;2)对 于多拷贝Chr Y DYS14的每个基因座（正向引物：5' -ATCGTCCATTTCCAGAATCA ;反向 引物：5'-GTTGACAGCCGTGGAATC;探针：5'-FAM-TGCCACAGACTGAACTGAATGATTTTC-BH Ql) ;3)对于 Chr 1 基因座 EIF2C1 (正向引物：5' -GITCGGCTITCACCAGTCT ;反向引物： 5' -CTCCATAGCTCTCCCACTC ;探针：5' -HEX-CGCCCTGCCATGTGGAAGAT-BHQ1)。通过 dPCR 分析 软件v3. 0将每种基因座的拷贝数计算为拷贝数/ml提取的样品并且对测定的尿肌酸酐 校准。通过定量PCR(qPCR)、使用引物和标记的探针（IDT, Coralville，IA)(正向引物： 5'-GCC TGT MT CCC AGC TAC TC-3' ；反向引物：5'-ATC TCG GCT CAC TGC AAC-3' ；探针： 5'-5HEXTTCA AGC GAT TCT CCT GCC TCA GC 3BHQ1-3'）计算 ALU 重复单元。标准方案用 于标准条件（1〇1^11，95°(：;158 95°(：的40个循环；3〇8,60°(：)下的厶81￥11厶7(厶口口116(1 Biosystems，Foster City，CA)上的 qPCR 反应。人基因组 DNA(Promega，WI)用作 ALU 重复 单元的校准标准。
[0175] 统计学分析：使用未配对双尾斯氏T-检验（参数）或曼-怀二氏检验非参数） 分析标称的临床变量。使用Fisher确切检验与双尾P-值分析范畴临床和组织病理学数 据（Banff评分彡1)。使用Spearman秩相关系数建立相关性，其中相关性彡0. 3和p-值 〈〇. 05被视为具有显著性。小于0. 05的概率被视为对于所有统计学分析具有显著性，其使 用 GraphPad Prism(Graphpad Software Inc. ,La Jolla, CA)计算。除非指定，否则将所有 值表示为平均值土标准偏差。
[0176] 血浆供体衍生的无细胞DNA(dd-cfDNA)在急性肾移植物损伤中增加：在选择的19 位男性移植物的女性接受者的组中，当与稳定（STA)移植物功能期间测定的血浆dd-cfDNA 值比较时，在AR时存在更大量的血浆dd-cfDNA (AR所Chr Y多拷贝基因座DYS14的平均拷 贝数/mL血浆为3268±1917与STA的1385±378) (p = 0. 13)(图7)。当评价单一基因座 Chrl SRY时，血浆中几乎不存在dd-cfDNA的信号。当对于血浆中单一基因座SRY的3份单 独的血浆样品拷贝数检测重复时，我们观察到信号仅来自3份样品之一，且计算的平均拷 贝数为〇. 65± 1. 12/ y 1负荷的DNA样品，而对于多基因座DYS14,同一样品上的拷贝数为 82. 82±73. 52。
[0177] 尿中dd-cfDNA的分析：如上所述，血浆中单一基因座SRY的检测是不可能的。而 来自ChrY的基因座SRY拷贝数分析的dd-cfDNA的信号对于活组织检查证实的AR显示最 高尿负荷，尿dd-cfDNA的显著增加在具有急性肾移植物损伤其它病症例如ATN和BKVN中 也可以观察到。
[0178] 具有末期肾病的接受者的天然肾组织是无功能的。知晓了这些，在相同的20位女 性接受者或男性供体肾中测定单一基因座EIF2C1 Chr IcfDNA(来自常染色体的cfDNA负 荷）并且使结果/样品与得自如基因座SRY拷贝数测定的相同样品中尿Chr Ydd-cfDNA负 荷的结果建立相关性。
[0179] 如Chr 1基因座EIF2C1分析的拷贝数测定的尿cfDNA负荷几乎完全来源于供体； 因为Chr Y基因座SRY和Chr 1基因座EIF2C1的尿cfDNA负荷高度相关（r = 0. 96, R2 0? 88, p 值〈0? 0001;图 8)。
[0180] 尿Chrl cfDNA拷贝数与非特异性急性肾移植物损伤相关：接下来在独立的不 同性别组合的37个供体/受体对的小组中测定尿Chr I cfDNA负荷。存在Chrl基因座 EIF2C1的更广泛的变化，其中在全部样品中，0-21. 57拷贝数/ y g尿肌酸酐，中位值为0. 97 拷贝数，与表型无关。来自AR患者的尿的Chrl基因座EIF2C1的拷贝数为4. 87± 1.22拷 贝数/ y g尿肌酸酐，其显著地高于来自无损伤表型的尿中Chrl基因座EIF2C1的拷贝数 (STA)O. 93±0. 15