番茄早疫病菌pcr检测特异引物及其检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及番茄早疫病菌PCR检测特异引物及其检测方法，属于农作物病害检测、鉴定及防治技术领域。
【背景技术】
[0002]番蔽{So Ianum lycopersicum L.)是全球广泛种植，高消费量的蔬菜作物之一，中国是番茄出口大国，在南北均有大面积栽培。番茄果实营养极为丰富，品种类型较多，既能作为水果生食，也能作蔬菜成为餐桌上的美味佳肴，还能被加工成番茄酱、番茄汁等功能性罐装食品，为消费市场创造了良好的经济效益。随着栽培技术的进步，近年来主要通过保护地栽培模式生产番茄供应市场，优良的生长环境一方面延长了番茄的生长周期，促进了番茄生产，另一方面却滋生番茄病害的发生，破坏番茄植株的生长，威胁番茄的产量及品质甚至在采后储藏期造成危害。
[0003]由前链格孢菌IMtermria solani{E\A,Mhaxt).sorauer]侵染引起的番前早疫病是番茄生产上的主要病害之一，也是一种世界性病害，在美国、澳大利亚、以色列、印度、希腊等地发病率都很高，严重时可使产量损失35%-78%，80年代以来在我国黑龙江、吉林、山东、河北、山西、广东、湖北、江苏和福建等大部分地区也普通发生，危害日趋严重，一般年份发病率在10%左右，造成产量损失10%-30%，流行年份发病率可达100%，产量损失可达30%-40%，甚至绝收，成为露地、保护地番茄生产中的重要病害。番茄早疫病菌主要以菌丝和分生孢子随病株残体在土壤中越冬，气候条件适宜时，产生新的分生孢子是初侵染的来源，病斑上的分生孢子主要靠风雨等传播，通过气孔或伤口侵入，在条件适宜时，病菌侵入寄主后只需2-3天就可形成病斑，再经过3-4天即可产生大量的分生孢子，引起多次重复侵染。该病可以引起落叶、落花、落果和断技，对产量影响很大，严重时可以使产量损失50%以上，随着番茄早疫病的出现及其日益严重，因此，很有必要建立一套快速灵敏的检测方法用于番茄早疫病的早期诊断，防止其从发病区向未发病区传播，对番茄早疫病的及时控制具有重要意义。
[0004]为控制番茄早疫病的发生为害，世界各国踊跃开展了番茄早疫病菌的检测研究，传统的检测方法是采用选择性培养基从发病组织中分离病原菌，再对这些病原菌的形态特征等进行鉴定，或者利用肉眼和借助显微镜技术对发病症状进行判定。传统的检测方法不仅费时、准确度低，而且要求检测人员具有丰富的经验，不能满足病害防治中病原菌准确、快速检测的需求，易遗漏潜育期或隐症的病害，以致延误病害的防治，导致病害的暴发。因此，对番茄早疫病菌的检测、鉴定就需要在病害发病初期或在症状显现之前来进行，这样就要求有灵敏、快速的方法。
[0005]随着科学技术的发展，具有操作简便、快速、灵敏度高、特异性强等技术优势的PCR(聚合酶反应polymerase chain react1n)技术已逐步应用于植物病原菌的快速检测、鉴定，如柑橘黄龙病菌、柑橘溃疡病菌、大豆疫霉菌、辣椒疫霉菌等等。然而，通过对现有技术的文献检索发现，目前尚未有利用PCR技术检测番茄早疫病菌的报道。本发明通过对链格孢属(Wferaaria)真菌的ITS序列进行比对分析，设计出I对可用于特异性检测番前早疫病菌的引物，为番茄早疫病菌的准确鉴定和快速检测提供技术和方法，有利于及早有效地采取防治措施。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是针对现有技术中对番茄早疫病菌检测和鉴定主要基于形态学特征、耗时长、程序繁琐、经验性强、准确度低，难以做到对病害发生的及时监测和控制病原菌的传播、流行的问题，提供了一种番茄早疫病菌PCR检测特异引物及其检测方法，利用本发明所述的PCR检测特异引物进行番茄早疫病菌检测和鉴定具准确性高、特异性强、灵敏度高、易于操作、检测时间短且结果可靠。
[0007]实现本发明的目的包括下列步骤(技术方案):
1.番前早疫病菌(Altermrieisolani) PCR检测特异引物的设计
采用真核生物ITS通用引物ITS1:5’-TCCGTAGGGAACCTGCGG-3’和ITS4:5' -TCCTCCGCTTATTGATAT GC-3’对番茄早疫病菌和链格孢属Uheraaria印/?)真菌中不同种以及其它病原菌的核糖体转录间隔区(ITS)基因进行扩增，PCR反应体系25 μ?,包括2Χ T1a^7 PCR Master Mix (北京天根生化科技有限公司)12.5μ?，10 Mmol/L的ITSl/ITS4引物各1.0μ?，2.0X 10 5?200 ng DNA模板，用无菌超纯水补足至25 μ?。扩增反应程序为:94°C预变性5min ;94°C变性I min、55°C退火30 S、72°C延伸I min，35个循环，最后72°C延伸10 Hiin0将PCR扩增产物送至上海生工生物工程有限公司进行测序，将测序得到的ITS序列与GenBank中Wteraaria属不同种的ITS基因序列进行同源性比较分析，根据基因序列差异位点，用Primer Primer5软件设计出番茄早疫病菌PCR检测特异引物，基喊基序列为:
上游引物 ASF:5’ - ACCACAAGGACCAACCCATA -3’，
下游引物 ASR:5’- CCTACCTGATCCGAGGTCAA -3’ ；
2.番茄早疫病菌PCR快速分子检测的建立
Cl)提取待测样品(病原菌纯培养物、带菌植物组织或土壤)基因组DNA。
[0008]用于检测病原菌纯培养物时，采用CTAB法提取供试菌株基因组DNA，具体方法如下:取少量菌丝粉于1.5 mL离心管中(菌丝粉刚盖过半圆形底部为宜)，加入900 μ?2%CTAB (十六烷基三甲基溴化铵)提取液(2% CTAB ；100 mmol/L Tris-HCl, pH 8.0 ；20mmol/L EDTA, ρΗ8.0 ；1.4 mol/L NaCl)和 90 μ? SDS (十二烷基苯磺酸钠)【注:CTAB, SDS需60°C预热】，使用振荡器振荡混匀，60°C水浴Ih (DNA释放至缓冲液中)，12000 r.min 1离心15 min ;取上清液700 μ?，加等体积酚、氯仿、异戊醇混合液(各体积比为25:24:1 )，轻轻振荡混勾，12000 r.min1离心9 min;取上清液500 KL，加入等体积氯仿再抽提一次，12000r.min 1离心5 min ;取上清液350 KL，加入1/10体积3 mol.L 1 NaAc和2倍体积无水乙醇，-20°C沉淀30 min，12000 r.min1离心5 min ;弃去上清液，加入700μ?体积浓度为70%冰乙醇进行洗涤(稍离心；倾掉上清液)，在超净工作台上晾干无酒精味，加入30~60 μ? TE(10 mmol/L Tris-HCl, 0.1 mmol/L EDTA, pH 8.0)溶液进行溶解，得到 DNA 溶液，用紫外分光光度计检测DNA浓度并稀释至25 ng/^L待用。
[0009]用于检测番茄植株组织是否存在番茄早疫病菌时，采用NaOH快速裂解法提取番茄植株组织基因组DNA，具体过程如下:向1.0 mg番茄植株组织(花、叶或果实)中加入0.5mol/L NaOH 30 KL，将组织充分磨碎成糊后转入1.5 mL离心管中，12，000 rpm离心6 min,取上清液5 μ?加入0.1 mol/L Tris-HCl (ρΗ=8.0)495μ?混合均匀，取1.0 μ?作为PCR模板进行扩增；
用于检测土壤中是否存在番茄早疫病菌时，采用土壤DNA提取法提取土壤中总微生物基因组DNA，具体过程如下:取已过200目筛的土壤冷冻抽干24-48 h后加入少量石英砂，倒入液氮充分研磨，将研磨后的土壤细粉分装至1.5ml离心管中，每管加入500 μ?质量浓度为0.4%脱脂奶粉溶液，涡旋混匀，12，000 rpm离心15 min,取上清液加入等体积蛋白酶K缓冲液，加终浓度为lOPg/mL蛋白酶K，55°C水浴60min，水浴结束后，加入总体积为1/2体积的7.5M NH4AC溶液，上下颠倒混勾，12，000 rpm离心15 min，吸上清液加2倍体积无水乙醇-20°C沉淀20min以上，沉淀结束后，12，000 rpm离心10 min，倾掉上清液，用体积浓度为70%乙醇洗涤沉淀，室温凉干，每份样品所提DNA用20 μ? TE (或无菌超纯水)溶解，取1.0PL作为PCR模板进行扩增。
[0010](2)以步骤(I)提取的DNA为模板，利用ASF/ASR这一对引物进行PCR扩增。PCR反应体系25 μ?，包括2Xrai7 PCR Master Mix (北京天根生化科技有限公司)12.5μ?，10Mmol/L的ASF/ASR引物各1.Ομ?，2.0 X 10 5?200 ng DNA模板【1.Ομ?步骤(I)提取的基因组DNA】，用无菌超纯水补足至25 PL;扩增参数为:95 °C预变性5 min, 94 °C变性30 S，60 °C退火45 s，72 °C延伸30 s，共35个循环，最后72 °C延伸10 min。
[0011](3)取步骤(2)的PCR扩增产物5.0 μ?用1.5%琼脂糖凝胶进行电泳分离，电泳结束后经溴化乙锭染色于紫外灯下观察，根据扩增产物的有无及其片段大小对结果进行判断，如果能特异性地扩增出约409bp的产物，即可判断所述的检测样品中存在番茄早疫病菌，否则所述的检测样品中未存在番茄早疫病菌。
[0012]本发明的显著优点
本发明与现有技术相比，具有以下的技术优势和有益效果:
1.特异性强、准确性高:本发明是根据真菌核糖体转录间隔区(internal transcribedspacer, ITS)序列种内的保守性和科属种间可变性的特点，设计了对番茄早疫病菌具有特异扩增作用的PCR引物，并已经对不同地理来源的番茄早疫病菌和携带该病菌的番茄叶片和土壤进行了测试验证，只有番茄早疫病菌和携带该病菌的番茄叶片或土壤中能特异性地扩增出一条409bp的电泳条带，说明本发明所设计的引物具有很强的特异性和准确性。
[0013]2.灵敏度高:病原菌传统的检测方法是通过分离、纯化和形态学鉴定等步骤，这种传统方法的成功需要发病组织中积累到足够量的病原体才能成功。而本发明以多拷贝的ITS基因为番茄早疫病菌PCR分子检测的靶标，将设计的特异引物与ITS基因通用引物(ITS1/ITS4)联合起来进行巢式PCR扩增后，对番茄早疫病菌的检测灵敏度在DNA水平上可达到10fg，比常规PCR检测提高了 10000倍。
【附图说明】
[0014]图1为本发明所要检测的番茄早疫病菌的特异PCR扩增图，图中:泳道M为2000bp DNA Marker,泳道1_3为番前早疫病菌iAltenrnriEi solani'),泳道4_6分别为格树黑斑病菌1.ZllterimriB alternata),番前灰霉病菌iBotrytis ciflerea)和番前晚疫病菌(Phytoph thora infes tans')。
[0015]图2为本发明番茄早疫病菌的灵敏性检测扩增结果图，图2-a为单重PCR对番茄早疫病菌的灵敏性检测结果，图2-b为巢式PCR对番茄早疫病菌的灵敏性检测结果，图中泳道M为2000bp DNA Marker，泳道I为100 ng,泳道2为10 ng,泳道3为I ng，泳道4为100 pg,泳道5为10 pg,泳道6为I pg，泳道7为100 fg，泳道8为10 fg，泳道9为I fg，泳道10为阴性对照。
[0016]图3为本发明发病组织的检测结果图，图中泳道M为2000bp DNA Marker，泳道I为阳性对照，泳道2为番茄早疫病菌纯培养物，泳道3为发病的番茄叶片，泳道4为携带番茄早疫病菌的土壤，泳道5-6为健康番茄叶片，泳道7为无菌土样，泳道8为阴性对照。
【具体实施方式】
[0017]以下结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但不用来限制本发明的范围。以下实施例均按照常规实验条件，或已发表相关文献中所述的操作技术规程，或按照厂商所建议的