专利名称：解淀粉芽孢杆菌及其在番茄早疫病菌中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及微生物领域，尤指一种解淀粉芽孢杆菌B-004，同时还涉及该菌株对番茄早疫病菌的抑制作用。
背景技术：
早疫病菌是番茄果实采后腐烂变质的主要病原菌之一。目前对该病的防治主要是低温贮藏结合化学防腐剂的应用。但低温处理需要较大的投资，且容易造成番茄贮藏中的冷害问题，导致番茄在低温期间或出库后短期内出现腐烂。另一方面，长期使用化学药剂会导致病菌产生抗药性，降低化学药剂的防病效果，同时防腐剂对人体健康及环境产生不良影响。生物防治因无毒、高效、成本低，作为一种控制采后病害的新途径成为研究的热点。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对上述现有技术的不足，提供一种对番茄早疫病菌有明显抑制作用的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)B-004。本发明所述的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)B-004，已于2011 年1月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO. 4557。本发明菌株B-004具有下述性质本发明的解淀粉芽孢杆菌B-004在牛肉膏蛋白胨培养基平板上于37°C培养M小时，菌落呈圆形，表面褶皱粘稠，菌落不透明，颜色为白色。将本发明菌株B-004活化进行革兰氏染色、芽孢染色，于光学显微镜下观察到菌株为杆状，少链，芽孢中生，革兰氏染色阳性。本发明菌株的生理生化特征见下表1 表1本发明菌株B-004的生理生化检测表
生理生化特征结果生理生化特征结果明胶液化+H2S一葡萄糖产酸+接触酶试验+葡萄糖产气一V. P+乳糖产酸一M. R一乳糖产气一淀粉水解+55 0C一柠檬酸盐试验+7. 5%NaCl+
注阳性+、阴性_。通过对本发明菌株B-004的菌落形态、菌体观察及生理生化性状检测，参照《伯杰氏手册》初步确定本菌株B-004为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) 0 通过分析本菌株遗传特征的保守序列16S rDNA，发现本发明菌株B-004与解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的同源性为99 %，两者处于系统树的同一分支，结合本发明菌株B-004的菌落形态、菌体观察及生理生化性状检测结果，可以判定本发明菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的一个新种，命名为解淀粉芽孢杆菌 (Bacillus amyloliquefaciens)B—004。培养及发酵条件培养基中的营养源并无特殊的规定，培养基中可含有常用于微生物培养的碳源、 氮源及其他营养源。其中，碳源可为可溶性淀粉、藕粉、葡萄糖、乳糖、海藻糖、蔗糖等。氮源可为蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、NH4N03、NH4C1、(MM)2SO4等。其他营养源可为含钾、铁、锌、钠、 锰、镁及钙之类的金属盐等。对温度、时间等培养条件并无严格的限制，以适于本发明菌株的生长为宜。为提高本发明菌株有效成分的产量，通过单因素试验对本发明菌株的培养基成分进行优化，最佳培养基为可溶性淀粉20g，酵母膏8g，CaCl25g，蒸馏水1000mL。为进一步提高有效抗菌物质的含量，对本发明菌株发酵条件进行优化，以接种量2%，初始pH7. 0，装液量100mL/250mL，转速210r/min，30°C振荡培养4 为发酵条件时，其抑菌活性最高，经优化条件二次验证，抑菌圈从0. 2cm提高到了 0. 7cm，为进行发酵罐放大试验提供了基础。在制造以本发明所述菌株为有效成分的农用杀菌剂时，可使用该领域内已知的各种载体，并能配制成粉剂或水剂等剂型，配制成粉剂时需加10%乳糖作为保护剂、5%蛋白胨作再水化剂。杀菌剂中本发明菌株的浓度为IO6 108CFU/mL。本发明菌株对番茄采后早疫病菌具有明显拮抗效果，可抑制番茄早疫病菌的生长，达到防病效果，并可进一步制造以本发明所述菌株为有效成分的农用杀菌剂，从而，对利用生物防治途径来控制番茄贮藏期早疫病具有积极的现实意义。
具体实施例方式实施例1将从湖南长沙周边农户菜园采集的番茄果实，参照文献(刘杰凤，韩寒冰，张进凤，等.茄类内生菌的分离及拮抗细菌的筛选[J].安徽农业科学，2009，37 (3) :1160 1162)方法，采用研磨液培养法，将新鲜无病害番茄用流水洗净，切成小块，在75 %的酒精中浸泡3min，5% NaClO处理5min，无菌水反复冲洗5次，置于灭菌的研钵中研磨成浆液。将研磨液置80°C水浴保温30min后，用无菌水稀释10倍，取0. ImL涂布于NA培养基中，37°C 培养48h，观察菌落形态，挑取形态特征相异的菌落于NA培养基上划线分离，37°C培养4 后，取单菌落重复划线分离3次，纯化(李娟，陈亮，陈立，等.猕猴桃细菌性叶枯病生防芽孢杆菌筛选及田间防效[J].中国生物防治，2010, ) :235 239)，即可得到本发明菌株，纯化后菌株转接NA斜面保存备用。实施例2，本发明菌株对番茄早疫病菌的抑制作用1、将本发明菌株采用传统的平板对峙方法[孙建波，王宇光，赵平娟，等.香蕉枯萎病生防细菌的筛选、鉴定及其抑菌作用[J].中国生物防治，26C3) :347 351]进行拮抗
4试验，得知，本发明菌株对番茄早疫病菌具有拮抗能力，测得抑菌圈直径为0. 4cm02、参照文献[周防震.番茄采后病害拮抗酵母菌的筛选和应用[D].华中农业大学，2004]方法，将本发明菌株经培养后配成106、107、及108CFU/mL浓度，与103、104、 105SpOreS/mL三种浓度的番茄早疫病菌孢子液等体积(0. ImL)混合于NA改良培养基，
培养5d后观察结果，得知，本发明菌株浓度为106、IO7,108CFU/mL,能完全抑制ΙΟ3、104、 105spores/mL浓度的番茄早疫病菌孢子生长。3、番茄果实贮藏试验本试验所用番茄果实采自湖南农业大学周边农田，果实新鲜、健壮、无机械损伤， 品种为早丰1号、西优5号。果实采收后清水洗净，自然凉干，按下表2的处理方法喷洒番茄果实。自然凉干，单果包装后室温下贮藏，每组处理30个番茄果实，每隔15d检查发病情况。表2番茄果实贮藏试验设计
权利要求
1.一种解淀粉芽孢杆菌株，其特征在于该菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)B-004,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2011年1月17日，保藏编号为CGMCC NO. 4557。
2.如权利要求1所述的菌株在抑制番茄早疫病菌中的作用。
3.如权利要求1所述的菌株作为有效成分在制备农用杀菌剂中的作用。
4.如权利要求3所述的菌株在农用杀菌剂中的浓度为IO6 108CFU/mL。
全文摘要
一种解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)B-004，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2011年1月17日，保藏编号为CGMCC NO.4557。该菌株对番茄采后早疫病菌具有明显拮抗效果，可抑制番茄早疫病菌的生长，并可进一步制造以本发明所述菌株为有效成分的农用杀菌剂，对利用生物防治途径来控制番茄贮藏期早疫病具有积极的现实意义。
文档编号C12N1/20GK102154187SQ20111009511
公开日2011年8月17日 申请日期2011年4月15日 优先权日2011年4月15日
发明者夏菠, 易有金, 童志丹 申请人:湖南农业大学