检测转基因玉米mon810和mir604的多重dpo-pcr引物组合及方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学检测技术，具体地说，涉及一种检测转基因玉米M0N810和 MIR604的多重DP0-PCR引物组合及方法。
【背景技术】
[0002] 多重PCR是指在一个反应管内加入多对引物同时对多个靶基因进行扩增，可以 实现对样品的高通量检测，目前已经被广泛应用于转基因物种的检测。由于在PCR反 应体系内加入了多对引物，体系复杂，稳定性不高，限制了其使用。DP0(Dualpriming oligonucleotide)引物技术的主要原理为其引物包含两个各自独立的特异性引物区域， 5'端序列由18-25个碱基组成并与靶基因序列配对，3'端序列由6-12个碱基用来引导 PCR反应的特异性延伸，这两段独立的特异性区域利用寡聚次黄嘌呤（In〇Sine，I)进行连 接，由于次黄嘌呤比一般碱基的退火温度低，在退火时寡聚次黄嘌呤形成类似泡状的结构， 从而使5'和3'区域形两个独立功能的双特异性引物结构，研究表明5'和3'引物区域 中任何有3个及以上碱基的错配，PCR反应将不能进行，而且由于其特殊的结构，引物自身 以及引物之间很少形成二级结构且对退火温度不敏感。该技术的优点主要在于它对退火 温度等影响普通多重PCR的关键因素不敏感，适用范围广，而且该技术特异性强，扩增效率 高，为多重PCR技术的应用提供了新的前景。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供一种检测转基因玉米M0N810和MIR604的多重DP0-PCR引物 组合。
[0004] 本发明的另一目的是提供检测转基因玉米M0N810和MIR604的多重DP0-PCR方 法。
[0005] 为了实现本发明目的，本发明根据转基因玉米MIR604和M0N810的旁侧序列，设计 了如下检测转基因玉米M0N810和MIR604的多重DP0-PCR引物组合：
[0006] M0N810-F:5 ' -CTAACGTTTAACATCCTTTGCCATTIIIIIGCTATCTGTC-3 '(SeqID No. 1)；
[0007] M0N810-R:5，-TAGTGGGATTGTGCGTCATCCCTIIIIICAGTGGAGA-3，（SeqIDNo. 2);
[0008] MIR604-F:5，-GCACGCAATTCAACAGAAGGCGIIIIICGACAATC-3，（SeqIDNo. 3);
[0009] MIR604-R:5，-TGCGGTTCTGTCAGTTCCAAACGTIIIIIGGCTTGTC-3，（SeqIDNo. 4);
[0010] 其中，I为次黄嘌呤。
[0011] M0N810-F和M0N810-R为检测转基因玉米M0N810的引物，产物大小为266bp; MIR604-F和MIR604-R为检测转基因玉米MIR604的引物，产物大小为127bp。
[0012] 本发明还提供含有所述引物组合的用于多重DP0-PCR检测转基因玉米M0N810和 MIR604的试剂盒。
[0013] 优选地，所述试剂盒还包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、Mg'PCR反应缓冲液等中的至 少一种。
[0014] 更优选地，所述试剂盒还包括阳性对照。
[0015] 本发明进一步检测转基因玉米M0N810和MIR604的多重DP0-PCR方法，即利用所 述引物组合进行多重DP0-PCR检测转基因作物。
[0016] 具体地，所述方法包括以下步骤：1)提取待测转基因作物样品中的DNA;2)以步骤 1)中提取的DNA为模板，进行多重DP0-PCR扩增反应；3)分析扩增产物。
[0017] 多重DP0-PCR反应体系以50yL计为：
[0018]
[0019] 其中，Mix1内含DNA聚合酶，Mix2内含dNTPs、MgCl2、反应缓冲液；Mix1和Mix 2购自TaKaRa公司，货号为RR060A。
[0020] 多重DP0-PCR反应条件为：94°C1 分钟；94°C30 秒，45°C~60°C90 秒，72°C90 秒， 共40个循环；72°C10分钟。
[0021] 优选地，多重DP0-PCR反应条件为：94°C1分钟；94°C30秒，60°C90秒，72°C90 秒，共40个循环；72°C10分钟。
[0022] 前述的方法，步骤3)中采用2%琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，转基因玉米 M0N810的扩增产物大小为266bp，转基因玉米MIR604的扩增产物大小为127bp。
[0023] 本发明根据转基因玉米MIR604和M0N810的旁侧序列，分别设计特异性DP0-PCR 引物，并基于这些引物建立了检测转基因玉米M0N810和MIR604的多重DP0-PCR方法，可实 现对转基因作物样品的定性检测。实验表明，本发明的检测方法特异性好、通量高、快速，提 高了检测效率，为转基因玉米MIR604和M0N810的检测提供了更有效的方法。
【附图说明】
[0024] 图1为本发明实施例1中多重DP0-PCR扩增产物的电泳检测结果。其中，1 :转基 因玉米MIR604 ;2 :转基因玉米M0N810 ;3 :转基因玉米MIR604、M0N810。
[0025] 图2为本发明实施例3中多重DP0-PCR引物组合的灵敏度电泳检测结果。其中， 卜5 :两种转基因玉米DNA模板量依次为50ng、5ng、0. 5ng、0. 05ng和0? 005ng。
[0026] 图3为本发明实施例4中多重DP0-PCR引物组合的退火温度敏感实验的电泳检测 结果。其中，1-4 :退火温度分别为45 °C、50 °C、55 °C和60 °C。
【具体实施方式】
[0027] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明， 实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册（SambrookJ&Russell DW,Molecularcloning:alaboratorymanual, 2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。
[0028] 以下实施例中使用的转基因玉米M0N810、转基因玉米MIR604、转基因玉米 TC1507、转基因玉米M0N863、转基因玉米BT176、转基因玉米M0N89034、转基因大豆 GTS40-3-2、转基因水稻TT51-1、转基因油菜GT73由中国检验检疫科学研究院提供。
[0029] 实施例1检测转基因玉米M0N810和MIR604的多重DP0-PCR方法
[0030] 一、多重DP0-PCR引物组合的设计
[0031] 根据转基因玉米MIR604和M0N810的旁侧序列，设计了如下检测转基因玉米 M0N810和MIR604的多重DP0-PCR引物组合（引物序列中的I为次黄嘌呤）：
[0032] M0N810-F:5 ' -CTAACGTTTAACATCCTTTGCCATTIIIIIGCTATCTGTC-3 '(SeqID No. 1)
[0033] M0N810-R:5，-TAGTGGGATTGTGCGTCATCCCTIIIIICAGTGGAGA-3，（SeqIDNo. 2)
[0034] MIR604-F:5，-GCACGCAATTCAACAGAAGGCGIIIIICGACAATC-3，（SeqIDNo. 3)
[0035] MIR604-R:5，-TGCGGTTCTGTCAGTTCCAAACGTIIIIIGGCTTGTC-3，（SeqIDNo. 4)
[0036] 其中，M0N810-F和M0N810-R为检测转基因玉米M0N810的引物，产物大小为 266bp;MIR604-F和MIR604-R为检测转基因玉米MIR604的引物，产物大小为127bp。
[0037] 二、检测转基因玉米M0N810和MIR604的多重DP0-PCR方法
[0038] 1、DNA的提取
[0039] 参照试剂盒说明操作（植物基因组DNA提取试剂盒，货号为DP305-02,天根生物科 技有限公司）分别提取转基因玉米M0N810和MIR604的基因组DNA。
[0040] 2、多重DP0-PCR扩增
[0041] 采用M0N810-F、M0N810-R、MIR604-F和MIR604-R共 4 条多重DP0-PCR引物，分别 以如下3组的基因组DNA为模板进行多重DP0-PCR扩增，分别得到多重DP0-PCR扩增产物：
[0042] 组1以转基因玉米M0N810的基因组DNA为模板；
[0043] 组2以转基因玉米MIR604的基因组DNA为模板；
[0044] 组3以转基因玉米M0N810和MIR604的基因组DNA为模板。
[0045] 多重DP0-PCR反应体系如表1所示。其中，Mix2内含dNTPs、MgCl2、反应缓冲液； Mix1内含DNA聚合酶，Mix2和Mix1购自TaKaRa公司，货号为RR060A。
[0046] 多重DP0-PCR反应条件：94°C预变性lmin;然后94°C变性30s，60°C退火90s，72°C 延伸90s，在此条件下进行40个循环；最后72°C再延伸10min。
[0047] 表1多重DP0-PCR反应体系
[0048]