) [J].Plantbiotechnologyjournal, 2004, 2(5) : 367-380.)，回收片段，与从中间载体上切 下的0sHAK5基因片断通过T4DNA连接酶定向连接。连接产物转化到大肠杆菌DH5a感受 态细胞中，涂在含有50yg/ml卡那霉素的LB固体培养基上生长12-16h后，挑取阳性克隆， 保存阳性克隆，提取大肠杆菌质粒送公司测序。最后通过电击法将pTCK303-0sHAK5质粒转 化至EHA105农杆菌感受态细胞中，转化后涂在含有利弗平（Rfp)、卡那霉素（Kana)和链霉 素（Str)均为50yg/ml的YEP固体培养基上生长48-72h后，挑取阳性菌落，提取质粒，回 转大肠杆菌，提取质粒经测序验证无误后，将农杆菌菌液加入等体积30%甘油于-70°C冰 箱保存，后续试验备用。
[0059] 3.转基因水稻的获得将以上获得的转有pTCK303-0sHAK5质粒的农杆菌，侵染水 稻愈伤组织，共培养（暗培）2. 5天后洗菌，将晾干的愈伤转入含500mg/L羧苄青霉素（Car) 和50mg/L潮霉素（Hyg)的选择培养基上进行第一轮选择培养，28°C光照培养2周，将长有 抗性愈伤的愈伤转到含500mg/L羧苄青霉素和80mg/L潮霉素的选择培养基上进行第二轮 选择培养，28°C光照培养，直到长出颗粒性的抗性愈伤组织。挑取同一愈伤来的颜色鲜黄的 抗性愈伤转入装有分化培养基的塑料广口瓶中分化培养，等待分化成苗（25-30d)，待苗长 至2-3cm左右，放入生根培养基中壮苗。将分化好的苗从生根管挑出，加入适量无菌水，炼 苗一周。洗去根部琼脂培养基，移栽到水稻营养液中生长并进行阳性苗鉴定，阳性苗转入大 田至收获，得到T1代转基因种子。
[0060] 其中使用的培养基均为现有技术。
[0061] 4?转基因水稻Southernblot拷贝数鉴定。
[0062] 分别采用2种核酸限制性内切酶BamHI、EcoRI，对野生型和转基因水稻DNA样 品进行基因组DNA的消化，在1. 0%琼脂糖凝胶上分离消化产物，并进行Southern印迹，结 果见图1B，鉴定出的T1代单拷贝转基因水稻三个独立的株系（0X1，0X2, 0X3图1B)扩繁后， T2代用于后续表型观察和生理指标的测定。
[0063] 5.0sHAK5转基因水稻材料超表达效果鉴定将野生型和T2代转基因水稻种子（去 颖壳）放入50ml无菌离心管中，加30%次氯酸钠溶液浸泡10min;倒去次氯酸钠溶液，无菌 水清洗4-5遍，最后一遍浸泡30min。将种子小心转移到无菌滤纸上吸干，用无菌的镊子将 种子小心地置入灭菌的IRRI固体培养基上（0.4%phytagel)，在组培室中28°C培养2周。 野生型和转基因水稻0sHAK5基因的超表达效果鉴定：
[0064] 取2周的野生型和转基因根系和地上部迅速置于液氮中冷冻保存，按照常规方法 提取总RNA，用质量比为1. 5%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量，并用分光光度计检测总RNA 的浓度和纯度利用上一步提取的总RNA反转录合成总cDNA，反转录试剂盒购自Fermentas 公司，Canada。半定量PCR(RT-PCR)和定量PCR(qPCR)分别以反转录出来的野生型和转基 因水稻的根和叶片cDNA为模板，设计特异性水稻内参和0sHAK5基因引物，引物序列见表1。 按表2组份配制PCR反应液（冰上配制反应液）。
[0065] 表1水稻内参和K+转运体基因0sHAK5的半定量和定量引物
[0066]
[0069] PCR反应条件如下：
[0070]
[0071] 为了检测转基因水稻中0SHAK5基因的超表达效果，我们正常水培2周的野生型和 转基因水稻根和叶片的中〇sHAK5基因表达的半定量（RT-PCR)和定量（qPCR)检测结果发 现，转基因水稻植株根部和地上部中的0sHAK5基因表达显著高于野生型（图1C-D)。与野 生型水稻相比，转基因T1代水稻植株代呈现出株高降低，分蘖增加的表型（图1B)。
[0072] 实施例3野生型和转基因水稻的桶培表型及主要农艺性状指标统计
[0073] 为了明确转基因水稻T1代水稻材料出现的株高降低，分蘖增加的表型是否可以 重复，我们通过分子手段鉴定了三个单拷贝且〇sHAK5基因的超表达效果稳定的三个独立 的T2代水稻株系，使用1/2MS培养基发苗10天，挑选长势一致的水稻幼苗转移到完全水稻 营养液中，水培2周后进行正常施肥条件下的桶培试验，在水稻成熟期对野生型和转基因 水稻进行相关的农艺性状指标统计，统计结果表明，转基因水稻在T1代的桶培表型是能够 进行稳定遗传的，具体表现为与野生型水稻相比，转基因水稻株高降低，总分蘖和有效分蘖 数增多，尽管结实率较野生型有所降低，但由于有效分蘖比野生多，最后单株产量比野生型 显著提高，具体的的表型和农艺性状指标见图2A-B。
[0074] 实施例4野生型和转基因水稻根系构型的比较分析
[0075] 钾素营养对根系的正常生长具有重要作用，与氮、磷不同，缺钾能够引起水稻 根系发育不良，根冠比减小，地上部的糖分往根部运输受阻（Maetal.，2012;Caiet al.，2012)。前期研究结果表明0sHAK5在根部表皮以及中柱部分高度表达，且受外界环境 的缺钾诱导。将0sHAK5的启动子融合GUS进行染色发现，该基因在侧根和侧根发生原基处 高度表达，且受缺钾诱导表达增强（图3)。通过对野生型和转基因水稻材料进行正常和缺 钾处理7天观察主根的表型，发现正常供钾（lmM)的情况下，野生型材料和超表达材料根尖 有大量的根毛产生，且表现出相似的侧根密度和侧根长度，缺钾（OmM)的情况下野生型材 料根毛减少，根尖根毛长度缩短，侧根伸长受到抑制。相比较超表达材料根尖根毛的生长则 受到促进，增加约一倍，侧根的影响不大（图4A-B)。因为不同材料根系形态不同，为了探明 此种表型是否跟根系内特定部位的钾浓度相关，进一步将根系分段采样，利用ICP测定不 同部位K+浓度，结果表明，在相同钾素条件下与野生型材料相比，超表达材料根系的相同部 位钾离子的浓度基本一致（图4C)，K+浓度测定说明转基因水稻根系形态的变化与其根部 K+浓度没有直接的关系。
[0076] 实施例5野生型和转基因水稻加K和缺K下的桶培表型及农艺性状指标统计
[0077] 为了研究0sHAK5在钾素营养和增加有效分蘖，增加家水稻产量方面的协同作用， 我们对野生型和转基因水稻材料进行桶培实验，试验地点在南京农业大学牌楼基地的温室 中进行，桶培所用土壤取自南京市地区的酸性黄棕壤，经测定其pH为5. 08,用1M的NH40Ac 浸提法测定土壤中速效钾含量为32. 03mg/kg属于极度缺钾土（查阅土壤农化分析书如果 土壤速效钾含量（mg/kg)〈50极低；51-83低；84-116中；>116高），每桶装土 7. 5kg，不外源 施加钾肥的缺钾土壤作为-K处理，外源施加0. 2g/kg的KC1的土壤作为+K处理，IRRI培养 3周大的苗挑选长势一致的单株移栽，每桶2株苗，8个重复，直至培养到成熟收获，桶培农 艺性状表明：转基因水稻在正常供K和缺K处理下，株高降低，有效分蘖数增多，从图上看， 0sHAK5转基因植株表现为更加耐低钾，具体的农艺指标统计见表3。桶培试验结果表明，转 基因水稻表现出增加有效分蘖和耐低钾胁迫能力比野生行水稻要强，从而达到了水稻增产 和养分高效的协同作用（图5)。
[0078] 表3野生型和转基因水稻加K和缺K下的桶培表型及农艺性状指标统计
[0079]
【主权项】
1. 水稻K +转运蛋白基因OsHAK5在增加植物的有效分蘖数和/或提高植物产量中的应 用，所述的水稻K+转运蛋白基因OsHAK5Gene Bank登录号为AK241580。2. 水稻K +转运蛋白基因OsHAK5在增强植物的耐低钾能力，提高植物的钾素养分高效 利用中的应用，所述的水稻K +转运蛋白基因OsHAK5Gene Bank登录号为AK241580。3. 水稻K +转运蛋白基因OsHAK5在创建耐低钾胁迫，提高水稻有效分蘖的养分高效和 水稻高产的新的水稻种质中的应用。
【专利摘要】本发明公开了水稻钾离子转运蛋白基因OsHAK5的基因工程应用。水稻K+转运蛋白基因OsHAK5在创建耐低钾胁迫，提高水稻有效分蘖的养分高效和水稻高产的新的水稻种质中的应用。本发明中，世界上首次发现由水稻K+转运蛋白基因OsHAK5构建的重组表达载体，通过农杆菌介导的水稻转基因技术转染到野生型水稻日本晴(Oryza？sativa.ssp.cv.Japonica)中，OsHAK5转基因水稻材料的总分孽、有效分蘖数、生物量和籽粒产量比野生型水稻极显著提高。
【IPC分类】A01H5/00, C12N15/84, C12N15/29
【公开号】CN105112443
【申请号】CN201510594272
【发明人】余玲, 徐国华, 杨天元, 张松
【申请人】南京农业大学
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2015年9月17日