>[0028] 于试管中，加入0. 5ml预处理后的柞蚕丝脱胶工业废水，用蒸馏水补足至1ml，加 入5mlFolin-酚试剂甲，在旋涡混合器上迅速混合，室温（20~25°C)下放置lOmin，再加 入0. 5mlFolin-酚试剂乙，立即混匀，室温下放置30分钟，以lml蒸馏水代替样品做空白 对照，于700nm处测定吸光度值（0D值），结果如表2。
[0029] 表2.柞蚕丝脱胶工业废水中蛋白质含量测定结果
[0030]
[0031](三）从柞蚕丝脱胶工业废水中制备丝胶蛋白
[0032] 1、盐析法粗提丝胶蛋白
[0033] 按硫酸铵饱和度80%加入硫酸铵。于500ml离心筒中加入250ml预处理后的柞蚕 丝脱胶工业废水和140g硫酸铵，充分搅拌至硫酸铵完全溶解，测得pH为9,用盐酸调节pH 至3. 8-4. 5,4°C静置12小时进行盐析。
[0034] 盐析后，盐析液在离心机内8000r/min条件下离心30min，在离心筒底部和瓶壁有 大量沉淀，呈白色，去除上清液，用水溶解残留的沉淀物，获得195ml丝胶蛋白粗提物。
[0035] 2、透析法除盐离子
[0036] 1)透析袋的预处理
[0037] 将透析袋剪成适当长度的小段。本实施例取10cm的长度。
[0038] 将透析袋在500ml的2% (m/v)碳酸氢钠和llmmol/L的EDTA.2Na(pH=8)的混 合液中煮沸10分钟，蒸馏水冲洗干净后，再在lmm〇l/L的EDTA.2Na(pH=8)中煮沸10分 钟，冷却后4°C保存，备用。
[0039] 将透析袋用蒸馏水湿润后，置于1%苯甲酸钠或0.05%叠氮化钠中防腐处理lh， 然后保存在密闭的塑料袋中，保持其湿润状态，4°C冰柜中保存，备用。
[0040] 2)透析操作
[0041] 将已处理及检查过的透析袋用透析夹夹紧底端，每只透析袋中装入10ml丝胶蛋 白粗提液，留l〇ml左右空间，以防膜外溶剂大量透入袋内时将透析袋胀裂，再用透析夹夹 紧袋口。
[0042] 在500ml烧杯中倒入400ml蒸馏水作为透析溶剂，放入透析袋，用玻璃皿盖住，以 免杂物污染，放在磁力搅拌器上进行透析。
[0043] 每8小时换一次蒸馏水，确保透析袋内盐离子浓度高于透析溶剂中的盐离子浓 度，达到完全除盐的效果。24小时后，收集透析袋内丝胶蛋白溶液，即415ml去除了盐离子 的丝胶蛋白粗提物。
[0044] 透析操作过程中，透析袋中盐离子透过膜进入蒸馏水中，蒸馏水中的水分子透过 膜进入透析袋中，使透析袋吸水胀袋，小心倒出透析袋内丝胶蛋白溶液，溶液颜色变浅，但 体积大大增加。
[0045]3、醇析法提取丝胶蛋白
[0046] 1)配制缓冲液
[0047] 丝胶蛋白提取液冷冻干燥成粉末的过程是一个复杂的相变过程，在冻结、冻融、干 燥和储存过程中，存在着诱导蛋白质变性的因素，故在本发明中，配制缓冲液是十分重要 的。
[0048] 缓冲液配方为：甘露醇3%，甘氨酸0. 075%，溶液pH为8,水余量。
[0049] 2)乙醇沉淀法
[0050] 取500ml乙醇置于-20 °C冰箱内，备用。
[0051] 将10ml透析后获得的去除了盐离子的丝胶蛋白粗提物放入50ml离心管内，加 入-20°C的乙醇30ml，使乙醇的终浓度为75 % (v/v)，得混合液，将混合液于-20°C下醇析 12小时。醇析后，在4°C离心机内8000rpm条件下离心20min，去除上清液，得白色沉淀为丝 月父蛋白精提物。
[0052] 将丝胶蛋白精提物溶于缓冲液中，得到170ml的丝胶蛋白精提液。取1ml获得 的丝胶蛋白精提液，利用Folin-酚比色法测得醇析后的丝胶蛋白精提液中蛋白的浓度为 18.92mg/ml。4、冷冻干燥
[0053] 将醇析后获得的丝胶蛋白精提物溶于缓冲溶液中，然后置于培养皿中，用保鲜膜 封口包紧，用针头在保鲜膜上扎孔透气，之后于-20°C冷冻2小时，再在-80°C下冷冻12小 时，冷冻后置于真空冷冻干燥机中进行干燥48h，得目标产物丝胶蛋白冻干粉末3.7g。
[0054] 经计算柞蚕丝脱胶工业废水提取丝胶蛋白的提取率为57. 36%。
【主权项】
1. 一种从柞蚕丝脱胶工业废水中制备丝胶蛋白的方法，其特征在于：将柞蚕丝脱胶工 业废水经盐析法得丝胶蛋白粗提物，然后经透析法去除丝胶蛋白粗提物中的盐离子，再经 醇析法得丝胶蛋白精提物，经冷冻干燥获得丝胶蛋白冻干粉。2. 根据权利要求1所述的一种从柞蚕丝脱胶工业废水中制备丝胶蛋白的方法，其特征 在于：所述的盐析法步骤是：于柞蚕丝脱胶工业废水中加入硫酸铵，充分搅拌至硫酸铵溶 解，用盐酸调节混合液的pH至3. 8-4. 5,0-5°C静置10-15小时，离心，去除上清液，取沉淀物 为丝胶蛋白粗提物。3. 根据权利要求1所述的一种从柞蚕丝脱胶工业废水中制备丝胶蛋白的方法，其特征 在于：所述的透析法步骤是：将盐析法获得的丝胶蛋白粗提物装入透析袋中，将透析袋置 于蒸馏水中，在磁力搅拌器上进行透析，每5-10小时换一次蒸馏水，透析20-30h，得去除了 盐离子的丝胶蛋白粗提物。4. 根据权利要求1所述的一种从柞蚕丝脱胶工业废水中制备丝胶蛋白的方法，其 特征在于：所述的醇析法步骤是：于透析后获得的去除了盐离子的丝胶蛋白粗提物中加 入-20~-25°C的无水乙醇至乙醇的体积百分浓度为70-80%，-15~-25°C下静置10-15 小时，离心，去除上清液，取沉淀物为丝胶蛋白精提物。5. 根据权利要求1所述的一种从柞蚕丝脱胶工业废水中制备丝胶蛋白的方法，其特征 在于：所述的冷冻干燥步骤是：将醇析法获得的丝胶蛋白精提物溶于缓冲溶液中，然后置 于培养皿中，用保鲜膜封口包紧，用针头在保鲜膜上扎孔透气，之后于-20~-25°C冷冻2-3 小时，再在-75~-85°C下冷冻10-15小时，冷冻后置于真空冷冻干燥机中进行干燥，得目标 产物丝胶蛋白冻干粉。6. 根据权利要求5所述的一种从柞蚕丝脱胶工业废水中制备丝胶蛋白的方法，其特征 在于：所述的缓冲溶液是：按重量百分比，甘露醇3%，甘氨酸0.075%，pH为8,水余量。
【专利摘要】本发明涉及一种从柞蚕丝脱胶工业废水中制备丝胶蛋白的方法。本发明以柞蚕丝工业废水为原料，利用Folin-酚比色法对溶液中蛋白质总含量进行检测，并观察柞蚕丝废水的颜色与有无沉淀，测量其pH。利用盐析法粗体溶液中的丝胶蛋白，并且进行透析操作去除蛋白溶液中大量的盐离子。有机沉淀法进一步提取溶液中的丝胶蛋白，提高溶液中蛋白质纯度，以达到从柞蚕丝生产废水制备丝胶蛋白的目的。本发明不仅防止环境污染，解决了污水处理的问题，同时可将提取的丝胶蛋白应用于化妆品、食品、纤维与纺织业、医药和生物材料等领域，在现代新工业的研究中具有重大的意义。
【IPC分类】C07K1/14, C07K14/435, C07K1/30
【公开号】CN105131099
【申请号】CN201510477467
【发明人】胡风庆, 胡蝶, 李辉
【申请人】辽宁大学
【公开日】2015年12月9日
【申请日】2015年8月7日