mol/L，反向引物（SEQ ID NO. 2)0.4 ymol/L，DNA模板（1.2. 2 节提取获得）20ng/ y L，Taq 酶 0? 075U/ y L，ddH20 补足至 20 y L。
[0037] PCR 扩增条件：94°C 5min - 94°C 30sec，（54。(：、56。(：、58。(：）60sec，72°C 60sec，35 个循环一72°C 3min。应用1. 2. 3设计的引物对华支睾吸虫DNA进行PCR反应，反应完毕后， 取5 y L反应产物在1. 0%的琼脂糖凝胶上电泳，观察结果。
[0038] 将上述获得的线粒体C0I目的基因PCR产物直接送生工生物（上海）有限公司测 序，并将测序后的序列分别与NCBI核酸数据库中提供的序列进行比对，分析比对结果。
[0039] 1. 2. 5灵敏性与特异性试验
[0040] 特异性试验：对华支睾吸虫进行PCR检测的同时，还对简单异尖线虫、刺激隐核虫 和棘颚口线虫（DNA提取方法与1. 2. 2相同），均分别用华支睾吸虫特异性引物（本发明的 扩增引物）在同样反应条件下进行PCR扩增，以确定是否有交叉反应。
[0041] 灵敏性试验：用核酸测定仪（Nano Drop 2000)测定所提取的华支睾吸虫DNA浓 度，连续十倍浓度梯度稀释。按照1. 2. 4的扩增方法，将不同浓度的DNA进行PCR扩增，电 泳分析结果。
[0042] 2、结果
[0043] 2. 1囊蝴的形态学鉴定
[0044] 囊蝴是扁形动物门吸虫纲幼虫发育过程中的一个阶段，华支睾吸虫囊蝴主 要寄生在淡水鱼的鳃和肌肉中，以麦穗鱼最为常见。其囊壁呈椭圆形，长度大约为 0. 16_-0.20_，外侧由一层包囊包裹，高倍镜下可以观察到口吸盘和腹吸盘。本试验中将 收集到的囊蝴置于1〇〇倍光学显微镜下，可观察到囊蝴在包囊内运动活跃，在排泄囊内充 满大量的黑色颗粒，且形态符合华支睾吸虫的特点。
[0045] 2. 2华支睾吸虫目的基因扩增与测序分析结果
[0046] 2. 2. 1线粒体C0I基因PCR扩增结果
[0047] 用1. 2. 4方法对华支睾吸虫DNA进行扩增，电泳结果显示，在230bp左右出现特异 性条带，且无杂带，片段大小与预期相符合（见图1)。
[0048] 2. 2. 2线粒体C0I基因测序结果
[0049] 测序结果片段大小为228bp。比对分析后，证明该基因片段与预计扩增片段序列同 源性达到100%。
[0050] 具体序列信息如下：
[0051] GAGTTCCAGCAAGCATATATAATCATGAAAAAACCTTGATCCCCGTAGGCACACCTATAATCATAGTAA CCGAGCTAAAAAAAACAGCAGTCCCCAAATCCAGCCCAACAGTAAACATATGATGAGCTCAAACCACCCTACCCAGA CAAACTATAGCAAACATAGCCAACACCAAGCCCCCATAACCAAACAACGAATCTTTACCTGTTAAAGTAGTACAAAT GTGAC(SEQ ID NO. 3)〇
[0052] 2. 3特异性试验结果
[0053] 结果显示，以华支睾吸虫DNA为模板可以扩增出特异性条带，而以简单异尖线虫、 刺激隐核虫和棘颚口线虫DNA为模板不能扩增出目的条带（见图2)。
[0054] 2. 4敏感性试验结果
[0055] 已知华支睾吸虫的DNA浓度为400ng/ y L，将其进行10倍浓度梯度稀释后，应用 1. 2. 4方法进行扩增，本发明的扩增引物最低可检测到DNA含量为4pg的华支睾吸虫（见图 3) 〇
[0056] 从试验结果来看，因为采用了华支睾吸虫线粒体细胞色素C氧化酶亚基1(C0I)基 因设计引物，该引物能够准确的识别不同虫种的特异性序列片段，使得该检测方法的特异 性大大提高。敏感性试验进一步证实了该PCR方法良好的效果，在华支睾吸虫DNA含量只 有4pg的情况下，能准确的鉴定出华支睾吸虫的存在。本发明可以用于检测鱼体内的华支 睾吸虫囊蝴，并为其生活史、传播方式及危害程度的研究提供有效的技术支撑。
[0057] 具体实施例：
[0058] -种基于线粒体C0I基因检测华支睾吸虫囊蝴的PCR扩增试剂盒，包括PCR 扩增反应液，所述PCR扩增反应液包括：pH8. 3的Tris-HC110mmol/L，KC1 50mmol/L， MgCl2l. 5mmol/L, dNTPs 0. 8mmol/L,正向引物 0? 4 y mol/L，反向引物 0? 4 y mol/L，DNA 模板 20ng/ y L，Taq 酶 0? 075U/ y L。所述正向引物序列为：5' -GAGITCCAGCAAGCATATATAATC-3'（S EQ ID N0.1)，所述反向引物序列为：5'-GTCACAITTGTACTACTTTAACAGGTA-3'（SEQ ID N0.2)。
[0059] 以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的 限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。
【主权项】
1. 一种基于线粒体CO I基因检测华支睾吸虫囊蝴的PCR扩增试剂盒，包括PCR扩 增反应液，其特征在于，所述PCR扩增反应液包括：Tris-HCl 10mmol/L，KCl 50mmol/L， MgCl2L 5mmol/L, dNTPs 0. 8mmol/L,正向引物 0? 4 y mol/L，反向引物 0? 4 y mol/L，DNA 模板 20ng/ y L，Taq 酶 0? 075U/ y L。2. 根据权利要求1所述的PCR扩增试剂盒，其特征在于：所述正向引物序列为：5' -GAG TTCCAGCAAGCATATATAATC-3' 。3. 根据权利要求1所述的PCR扩增试剂盒，其特征在于：所述反向引物序列为：5' -GTC ACATTTGTACTACTTTAACAGGTA-3' 。4. 根据权利要求1或2或3所述的PCR扩增试剂盒，其特征在于：所述Tris-HCl的pH 为 8. 3〇5. -种基于线粒体COI基因检测华支睾吸虫囊蝴的扩增引物，其特征在于：所述扩增 引物包括正向引物和反向引物，所述正向引物序列为：5' -GAGTTCCAGCAAGCATATATAATC-3'， 所述反向引物序列为：5'-GTCACAITTGTACTACTTTAACAGGTA-3'。
【专利摘要】本发明公开了一种基于线粒体COI基因检测华支睾吸虫囊蚴的PCR扩增试剂盒及扩增引物，包括PCR扩增反应液，所述PCR扩增反应液包括：Tris-HCl？10mmol/L，KCl？50mmol/L，MgCl2？1.5mmol/L，dNTPs？0.8mmol/L，正向引物0.4μmol/L，反向引物0.4μmol/L，DNA模板20ng/μL，Taq酶0.075U/μL。本发明灵敏度高，特异性强，检测快速、准确，为华支睾吸虫感染的诊治和预防提供有效的技术手段。<!-- 2 -->
【IPC分类】C12Q1/68, C12N15/11
【公开号】CN105132414
【申请号】CN201510512094
【发明人】李孝军, 周圆, 白颉, 单长林, 沈飚, 杨赛军, 胡兴娟, 王素华
【申请人】舟山出入境检验检疫局综合技术服务中心
【公开日】2015年12月9日
【申请日】2015年8月19日