抗生素difluostatin A及其制备方法和在制备抗菌药物中的应用
【技术领域】：
[0001] 本发明属于工业微生物领域，具体涉及新的抗生素difluostatin A及其制备方法 和在制备抗菌药物中的应用。
【背景技术】：
[0002] Fluostatins类化合物结构多样且具有多种生物、药理活性。一些化合物有很强的 细胞毒或抑菌活性，有很好的应用前景。
【发明内容】
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[0003] 本发明的第一个目的是提供一种新的具有抗菌活性的fluostatin类二聚体化合 物 difluostatin A〇
[0004] 本发明的一种新的fluostatin类二聚体化合物difluostatin A，其结构如式（I) 所示：
[0005]
[0006] 本发明的第二个目的是提供fluostatin类二聚体化合物difluostatin A的制备 方法。
[0007] 本发明的化合物difluostatin A是从天蓝色链霉菌（Streptomyces coelicolor. )YFll-3的发酵培养物中制备分离得到的。
[0008] 本发明优选通过以下方法从天蓝色链霉菌（Streptomyces coelicolor. )YF11_3 的发酵培养物中制备得到化合物difluostatin A，具体步骤如下：
[0009] a、制备天蓝色链霉菌（Streptomyces coelicolor. )YF11_3的发酵培养物，将该发 酵培养物的发酵液和菌丝体分离开，发酵液经大孔树脂吸附，后用丙酮洗脱大孔树脂，洗脱 液回收丙酮后剩余的水混合液用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层经蒸馏浓缩后得到浸膏A ;菌 丝体先用丙酮浸提，浸取液回收丙酮后剩余的水混合液再用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层经 蒸馏浓缩后得到浸膏B ;
[0010] b、将浸膏A和浸膏B合并的粗提物经硅胶柱层析，用氯仿/甲醇作为洗脱剂，从 体积比100 :〇~0 :1〇〇进行梯度洗脱，收集氯仿/甲醇体积比95 :5梯度洗脱下来的馏分 Fr. 2,后经0DS反相中压液相色谱，用水/甲醇作为洗脱剂，从体积比100 :0~0 :100进 行梯度洗脱，收集水/甲醇体积比20 :80梯度洗脱下来的馏分Fr. 2-7,再过LH-20凝胶柱， 以氯仿/甲醇体积比1:1作为流动相洗脱，洗脱馏分再经薄层层析纯化分离，得到化合物 difluostatin A〇
[0011] 所述的a)步骤的制备天蓝色链霉菌（Streptomyces coelicolor. ) YF11-3的发 酵培养物优选通过以下方法制备：将活化的天蓝色链霉菌（Streptomyces coelicolor.) YF11-3接入种子培养基，28°C，200rpm，培养48h得种子液，将种子液以10 %的接种量接入 到发酵培养基中，28°C，200rpm，振荡培养120h，而制得发酵培养物，所述的种子培养基的配 方为每升培养基中含有：淀粉l〇g，酵母粉5g，蛋白胨4g，CaC0 3 2g，粗海盐30g，余量为水， pH 7. 2 ;所述的发酵培养基的配方为每升培养基中含有淀粉10g，鱼蛋白胨lg，玉米粉6g， 细菌蛋白胨2g，甘油5ml，CaC0 3 2g，粗海盐30g，余量为水，pH 7. 0。
[0012] 本发明的第三个目的是提供天蓝色链霉菌（Streptomyces coelicolor.) YF11-3在制备化合物difluostatin A中的应用，所述的天蓝色链霉菌（Streptomyces. coelicolor. )YFll-3是通过将载体pSET152片段置换到含有fluostatins的生物合成基因 簇的cosmid上，然后转化进天蓝色链霉菌（Streptomyces. coelicolor. )YF11中而得到的， 所述的fluostatins的生物合成基因簇的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0013] 本发明人通过实验发现，化合物difluostatin A对Klebsiella pneumonia ATCC 13883, Aeromonas hydrophila ATCC 7966, Staphylococcus aureus ATCC 29213 和 Enterococcus faecalis ATCC 29212 有生长抑制活性，其中对 Klebsiella pneumonia ATCC 13883， Aeromonas hydrophila ATCC 7966， Staphylococcus aureus ATCC 29213 的 MIC值分别是4 y g mL y g mL 1和8 y g mL i。因此，本发明的第四个目的是提供化合物 difluostatin A在制备抗菌药物中的应用。
[0014] 所述的抗菌药物优选为抗肺炎克雷伯菌、嗜水气单胞菌或金黄色葡萄球菌的药 物。
[0015] 本发明的第五个目的是提供一种抗菌药物，其特征在于，包含有效量的化合物 difluostatin A作为活性成份。
[0016] 所述的抗菌药物优选为抗肺炎克雷伯菌、嗜水气单胞菌或金黄色葡萄球菌的药 物。
[0017] 本发明从天蓝色链霉菌（Streptomyces coelicolor. )YF11_3分离得到1个新的 具有抗菌活性的fluostatin类化合物difluostatin A，其能用于制备抗菌药物，通过生物 工程或化学修饰可望开发成为抗菌新药。
[0018] 所述的天蓝色链霉菌（Streptomyces coelicolor. )YF11_3通过以下方法制备：
[0019] 一、Fluostatins及其相关化合物产生菌小单孢菌SCSI0 N160基因组DNA的提取
[0020] 将新鲜小单孢菌SCSI0 N160的菌丝体按照5 %的接种量接种于50mL的1#培养 基（淀粉1(^，酵母粉48，细菌学蛋白胨28，海盐1(^，加水定容至11，口117.2-7.4)中， 28-30°C，振荡培养约2-3天，4000rpm离心10分钟收集菌丝体。菌丝体用STE溶液（NaCl 75mM，EDTA 25mM，Tris-Cl 20mM)洗涤两次，向洗涤后的菌丝体中加入30mL STE溶液和终 浓度3mg/mL的溶菌酶，涡旋均匀，37°C温浴3小时，加入至终浓度0. 1-0. 2mg/mL的蛋白 酶K，混匀，37°C温浴10分钟，加入至终浓度1-2%的SDS，混匀，放入55°C水浴约1小时， 期间颠倒数次。加入等体积的酚-氯仿-异戊醇（V/V/V = 25:24:1)，混合均匀，置于冰 上冷却30分钟。12000rpm，4°C离心10分钟，然后用剪过的大口径枪头小心吸取上清到新 的离心管中，用同样的方法反复处理3次，然后用等体积的氯仿洗涤两次，12000rpm，4°C离 心10分钟。用剪过的大口径枪头将水相吸出转移至新的离心管，加入1/10体积3mol/L NaAc (pH5. 2)，混匀后再加入等体积的异丙醇，混匀后冰上放置，沉淀DNA。小心地用玻璃棒 将DNA纤维团转移至新的离心管中，用70%乙醇洗涤两次，将液体倾出，在37°C下略微烘 干，加5mL TE溶解，并加入3-5U的RNA酶，由此得到小单孢菌SCSIO N160基因组DNA。
[0021] 二、Fluostatins生产菌小单孢菌SCSION160基因组文库的建立
[0022] 首先通过一系列的稀释实验来确定限制性核酸内切酶Sau3A I的用量，在20 y L 体系中，含有17 y L的小单孢菌SCSIO N160基因组DNA，2 y L的10 X反应缓冲液和1 y L不 同稀释度的Sau3A I，其终止反应为4yL 0. 5mol/L EDTA和合适的上样缓冲液。通过摸索 确定了 〇. 025-0. 05U的酶活单位比较合适。在此基础上通过大量部分酶切得到30~42kb 的基因组DNA片段，用去磷酸化酶进行去磷酸化处理。
[0023] 用于构建文库的载体SuperCos 1质粒先用限制性核酸内切酶Xba I从两个cos序 列中间切开，然后进行去磷酸化处理，再从多克隆位点处用限制性核酸内切酶Bam HI切开， 获得两个臂。处理后的载体与之前制备的部分酶切的30~42kb的基因组DNA片段连接过 夜，连接体系为10 y L，含有1. 25 y g制备的基因组DNA片段和0. 5 y g处理后的SuperCos 1质粒，1 y L的10 XBuffer，0. 3U的连接酶。连接产物于65°C处理15分钟，使连接酶失 活。从-80°C冰箱中取出一管包装混合物（50 yL)置于冰上，将包装混合物在指间迅速融 化，小心吸取一半包装混合物（25 yL)至一个新的离心管中，加入10 yL热处理后的连接产 物，其余包装混合物于-80°C保存。小心混匀，30°C温浴90分钟，加入另外一半包装混合物 (25 y L)，30°C温浴继续90分钟。加入500 y L噬菌体稀释缓冲液（100mmol/L NaCl，lOmmol/ L MgCl2，10mmol/L