一种低损伤的结直肠癌细胞原代培养方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于细胞培养技术领域，具体设及一种低损伤的结直肠癌细胞原代培养方 法。
【背景技术】
[0002] 结直肠癌是常见的消化系统恶性肿瘤，近年来我国结直肠癌的发病率和死亡率呈 逐年上升趋势。多数结直肠癌患者就诊时已属中晚期，治疗花费大、效果差、远期生存率低。 同时给患者、家庭及社会带来了沉重的负担。结直肠癌具有较明显的癌前及癌症早期病变， 且时间长达十余年。运为结直肠癌及癌前病变的早期发现和早期治疗提供了机会。肿瘤标 志物的测定在肿瘤的诊断、疗效评估、检测复发和推测预后等方面起到重要的作用，对提高 临床肿瘤诊疗水平具有重要的意义。
[0003] 结直肠癌的发生是多基因变化过程，单一标志物筛查特异性和敏感性较低，难W 应对大样本人群的筛查。国内外针对结直肠癌肿瘤标志物方面的研究虽然很多，但是目前 应用于临床的结直肠癌肿瘤标志物一一〔64八4199八4125八4724等仍缺乏足够的灵敏性和 特异性，寻找新的与结直肠癌发展进程密切相关的肿瘤标记物，对早期诊断及干预结直肠 癌具有重要意义。但是迄今为止，尚未发现既灵敏又特异的肿瘤标志物可应用于临床结直 肠癌的检测。因此，寻找有效肿瘤标志物作为初筛手段、进行结直肠癌早期筛查、早期诊治 对阻断或延缓结直肠癌进展、改善患者预后和延长生存期具有重要意义。
[0004] 通过对结直肠癌组织细胞与正常结直肠粘膜细胞表达蛋白的高通量筛选，有可能 发现肿瘤组织与正常黏膜组织细胞蛋白表达谱的差异，进而发现新的肿瘤标志物。高通量 筛选肿瘤细胞表达的蛋白则需要设及到肿瘤细胞的原代培养，并且运种研究方法对原代培 养细胞的培养要求很高，要尽量避免实验操作中导致的细胞破裂或细胞膜损伤。 阳〇化]原代培养即为直接从机体取下细胞、组织和器官后立即进行培养，在结直肠癌的 研究中，癌细胞的原代培养未见报道采用机械破碎法直接生长，均采用传统的酶消化法，其 前期对结直肠癌组织进行机械剪碎，然后向剪碎的组织中加入酶消化，使其分散成为单个 细胞。
[0006] 传统的酶消化法具有W下缺陷：由于消化时间的原因（一个样本只能选定相同的 处理时间，比如W将略大的组织块消化成单一细胞为标准制定消化时间，必然造成较小的 组织块及游离细胞的消化过度)，会造成细胞消化不均匀甚至消化过度，损伤细胞膜，破坏 细胞，影响细胞活性，或者消化不彻底不利于高通量筛选实验的进行；酶的种类繁多，在消 化时选择酶的种类和浓度具有多变性，不同的组织其对酶的要求也不一样，需要复杂的条 件摸索。
【发明内容】
[0007] 基于现有技术的缺陷，本发明所要解决的技术问题是，提供一种对细胞损伤小、细 胞存活率高、操作简便易培养的低损伤的结直肠癌细胞原代培养方法。
[000引本发明解决其技术问题采用的技术方案为：一种低损伤的结直肠癌细胞原代培养 方法，其包括如下步骤： (1) 组织前处理：将结直肠癌组织经抗生素处理； (2) 切块； (3) 培养：将切好的组织块放入含抗生素的培养基中进行初期培养和正常培养，至细胞 贴壁。
[0009] 进一步的，步骤（1)将结直肠癌组织W无菌生理盐水冲洗，然后放入含抗生素的无 血清培养基浸泡。
[0010] 更进一步的，所述含抗生素的无血清培养基中抗生素为：500U/mL青霉素，500 yg/mL链霉素，1. 25yg/mL两性霉素B，80yg/mL庆大霉素。
[0011] 进一步的，步骤（2)切块为：将组织块放入细胞培养皿中，用无菌手术刀将组织切 碎至体积l-50mm3,优选15-30mm3。
[0012] 进一步的，步骤（3)所述初期培养采用初期培养基，其含有：体积分数为10%胎牛 血清；100U/mL青霉素；100yg/mL链霉素；0. 25yg/mL两性霉素B;80yg/mL庆大霉 素；2mmol/L谷氨酷胺。
[0013] 进一步的，步骤（3)所述正常培养采用正常培养基，其含有：体积分数为10%胎牛 血清；100U/mL青霉素；100yg/mL链霉素；0. 25yg/mL两性霉素B;2mmol/L谷氨酷 胺。
[0014] 进一步的，步骤（2)切块时使用-80°C预冷过的细胞培养皿；组织切块时，将细胞 培养皿置于冰上，组织块置于细胞培养皿中，低溫操作可W延缓细胞新陈代谢过程，从而较 久地保存组织活力，有效避免组织离体后缺血、缺氧所导致的细胞。
[0015] 进一步的，步骤（1)的组织经抗生素处理的同时，经白介素6抑制剂浸泡处理。
[0016] 具体包括如下操作步骤： (1) 组织前处理：选取结直肠癌组织，无菌生理盐水冲洗30sW上，用带有4种高浓度抗 生素及白介素6抑制剂的无血清RPMI-1640培养基浸泡；5-lOmin后，更换新鲜含高浓度抗 生素的无血清RPMI-1640培养基后再浸泡5-lOmin。浸泡过程中，不时摇晃，颠倒摇晃，6次/ 分钟，W更好相互接触和清洁浪泡液中白介素6抑制剂选用Sil化Xim油，浓度为1-15yg/ ml，优选 11Ji邑/mL; 此步操作可W中和坏死组织中的白介素6,减少其介导的细胞损伤，同时此操作也降低 了组织的取材标准；坏死组织小于标本总体积的=分之一即可，传统方法要求避开坏死组 织，随着医学的进步，今后肿物的临床取材就易受到限制，降低取材标准无疑是为科研工作 提供了前提和保障，大大提高了原代培养成功率； 步骤（1)中4种抗生素浓度： 500U/mL青霉素， 500yg/mL链霉素， 1. 25Jig/mL两性霉素B， 80yg/mL庆大霉素； (2) 切块：将组织块放入-80°C预冷过的细胞培养皿中，组织切块时，将细胞培养皿置 于冰上，组织块置于细胞培养皿中，用无菌手术刀切碎组织至体积l-50mm3,优选15-30mm3; (3) 无培养基培养：纯血清润洗培养瓶，组织块直接放置到培养瓶中，组织培养起始的 化不添加培养基，目的是为了加快贴壁并且贴壁更加牢固，化过后，待组织块粘到培养瓶 上，再添加ImL纯血清进行培养，纯血清培养24h; (4) 初期培养：用含有体积分数为10%胎牛血清、4种低浓度抗生素和2mmol/L谷氨酷 胺的RPMI-1640培养基继续培养48-7化，其中4种低浓度抗生素： 100U/mL青霉素， 100yg/mL链霉素， 0. 25Jig/mL两性霉素B， 80yg/mL庆大霉素； (5) 正常培养：用含有体积分数为10%胎牛血清、3种抗生素和2mmol/L谷氨酷胺的 RPMI-1640培养基换液普通培养，每5-7天换液；观察细胞贴壁情况；3种低浓度抗生素： 100U/mL青霉素， 100yg/mL链霉素， 0. 25yg/mL两性霉素B; (6) 确认细胞贴壁后，重点观察培养，依据具体情况换液。
[0017] 本发明的RPMI-1640培养基为本领域常见培养基，具体可参见"E16. 5小鼠胚胎膜 腺组织移植治疗实验性糖尿病"，中华普通外科杂志，2013年9月，第28卷第9期。
[0018] 本发明的有益效果在于： (1) 取材的时候，不需要刻意避免坏死组织，提高了取材效率，避免了材料浪费； (2) 将组织块放入细胞培养皿中，用无菌手术刀切碎组织，减少了对组织块的机械损 伤，另外，对切碎的组织块大小要求不严格，传统方法要求切碎至1mm3W下，本方法体积较 大的组织块也能达到培养效果，且15-30mm3的组织块效果比Imm3更佳； (3) 根据结直肠癌组织的特殊发生环境，配置特定的抗生素浓度，并且根据癌细胞的 生长周期特性改变浓度和种类，有利于抑制组织内的细菌繁殖，避免细胞染菌，提高了贴壁 率. (4) 血清润洗培养瓶和化无液体培养，促进快速贴壁；纯血清培养第一天加快组织对 体外培养环境的适应； (5) 谷氨酷胺保证细胞分裂的原料供给。
[0019] 本发明采用机械切块、配合特定的培养液对结直肠癌组织进行原代培养，避免了 传统机械破碎方法染菌率高的风险，也避免了酶消化法对细胞的损伤，最大限度的保证了 细胞的完整性，实现快速修复。发明人在试验中还意外的发现，培养开始阶段进行化无液 体培养，可W加快组织块贴壁的速度，并且使贴壁更牢固，组织块不易脱落，可加速细胞生 长。结直肠癌组织中急性炎症和坏死组织情况复杂，白介素6抑制剂的加入可W允许取材 时存在坏死组织。
【附图说明】
[0020] 图1为实施例1显微镜下观察结果； 图2为对比例显微镜下观察结果。
【具体实施方式】
[0021] 为使本发明的上述目的