、特征和优点能够更加明显易懂，下面将结合本发明实施 例中的【具体实施方式】，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述 的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领 域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保 护的范围。 阳0巧实施例1 实施例1 一种低损伤的结直肠癌细胞原代培养方法，其包括如下步骤： (1)组织前处理：选取结直肠癌组织，无菌生理盐水冲洗30sW上，用带有4种高浓度 抗生素及白介素6抑制剂的无血清RPMI-1640培养基浸泡；5-lOmin后，更换新鲜含高浓度 抗生素的无血清RPMI-1640培养基后再浸泡5-lOmin;浸泡过程中，不时摇晃，颠倒摇晃，6 次/分钟，W更好相互接触和清洁；浸泡液中白介素6抑制剂选用Sil化ximab，白介素6抑 制剂选用强生公司生产，浓度为11yg/mL; 此步操作可W中和坏死组织中的白介素6,减少其介导的细胞损伤，同时此操作也降低 了组织的取材标准；坏死组织小于标本总体积的=分之一即可，传统方法要求避开坏死组 织，随着医学的进步，今后肿物的临床取材就易受到限制，降低取材标准无疑是为科研工作 提供了前提和保障，大大提高了原代培养成功率； 4种抗生素浓度： 500U/mL青霉素， 500jig/mL链霉素， 1. 25yg/mL两性霉素B， 80yg/mL庆大霉素。
[0023] (2)切块：将组织块放入-80°C预冷过的细胞培养皿中，组织切块时，将细胞培养 皿置于冰上，组织块置于细胞培养皿中，用无菌手术刀切碎组织至体积15mm3。
[0024] (3)无培养基培养：纯血清润洗培养瓶，组织块直接放置到培养瓶中，组织培养起 始的化不添加培养基，目的是为了加快贴壁并且贴壁更加牢固，化过后，待组织块粘到培 养瓶上，再添加1血纯血清进行培养，纯血清培养2地。
[0025] (4)初期培养：用含有体积分数为10%胎牛血清、4种低浓度抗生素和2mmol/L谷 氨酷胺的RPMI-1640培养基继续培养48-7化，其中4种低浓度抗生素： 100U/mL青霉素， 100yg/mL链霉素， 0. 25Jig/mL两性霉素B， 80yg/mL庆大霉素。
[0026] (5)正常培养：用含有体积分数为10%胎牛血清、3种抗生素和2mmol/L谷氨酷胺 的RPMI-1640培养基换液普通培养，每5-7天换液；观察细胞贴壁情况；3种低浓度抗生素： 100U/mL青霉素， 100yg/mL链霉素， 0.25Jig/mL两性霉素B。
[0027] (6)确认细胞贴壁后，重点观察培养，依据具体情况换液。
[0028] 本发明的RPMI-1640培养基为本领域常见培养基，具体可参见"E16. 5小鼠胚胎膜 腺组织移植治疗实验性糖尿病"，中华普通外科杂志，2013年9月，第28卷第9期。
[0029] 实施例2 实施例2与实施例1不同之处在于步骤（1)组织前处理时，白介素6抑制剂Siltuximab的浓度为1yg/mL;步骤（2)切块至体积50mm3。
[0030] 实施例3 实施例3与实施例1不同之处在于步骤（1)组织前处理时，白介素6抑制剂Siltuximab的浓度为15yg/mL;步骤（2)切块至体积1mm3。 阳0川实施例4 实施例4与实施例1不同之处在于步骤（2)切块至体积30皿3。
[0032] 对比例 采用酶消化法进行结直肠癌组织的原代细胞培养，具体操作如下： 1、l-2cm3组织块，放到细胞培养皿中，加入IOmLRPMI-1640培养基(无血清)，用高压灭 菌手术剪去除非肿瘤组织和坏死组织； 2、 将组织转移至新培养皿中，切成小块。20mLRPMI-1640培养基(无血清)重悬组织块 并转移至50血锥形管中。室溫，120化pm6min，弃上清； 3、 10血TumorCellDigestionSolution重悬组织，37°C消化 4虹，伴揽拌； 4、 加入10血TumorCellSuspensionSolution吹焰混匀。IOOmm过滤器过滤混悬 液，收集滤液至一干净50mL锥形管中； 5、 室溫，1200巧m8min，弃上清。用 20血TumorCellSuspensionSolution重悬沉淀， 混匀，得到均值的细胞混合液； 6、 加入20血TumorCellPurificationSolution至一新50血锥形管中，标记为管 A，室溫 1200巧m2min; 7、 将5中所得20mL细胞悬液置于管A的溶液上层； 8、 将管A在室溫垂直静置6min; 9、 小屯、将移液吸头伸入锥形管底，从底部吸走6血TumorCellPurification Solution,移至一新50血锥形管中，标为管B; 10、 1200;rpm8min，弃上清； 11、 5mLRPMI-1640培养基(体积分数为10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100yg/mL 链霉素）重悬沉淀； 12、 将细胞移至6孔板的一个孔，培养3-4天。 阳〇3引效果例 将同一结直肠癌组织，分别采用实施例1和对比例的方法进行原代培养，对比例经步 骤12处理，培养3-4天未见细胞增殖，培养20天后与实施例1经正常培养20天后进行比 较，结果如图1、图2和表1。
[0034] 表1实施例1和对比例的培养结果
通过对比发现： 试剂盒(酶消化法）对组织块要求较高，操作步骤繁琐，操作耗时较长，从组织离体到开 始培养，需要6-化，肿瘤组织长时间脱离适宜生长的环境。从最终结果看，酶消化时对组织 的损伤非常大，最终所得细胞数量很少（小于5个/视野)，远远不能达到细胞培养的数量， 且所得细胞的结构有明显损伤，不能满足实验需求。
[0035] 本发明的方法，只需对组织块初步进行剪碎，而且对组织块的大小要求并不严格， 减少了剪切次数，减轻了对组织块的机械损伤程度，随后无需对剪切后的组织块进行酶消 化，进一步减少了对细胞的损伤。初步浸泡剪切后，即可进行培养，从组织离体到开始培养， 不会超过0.化，最大限度的减少了肿瘤组织细胞在非适宜生长环境的时间。从最终结果看， 重量相等的组织块处理后，相同视野下细胞数量比传统酶消化法多（多于70个/视野)，可 W满足下一步实验需求。
【主权项】
1. 一种低损伤的结直肠癌细胞原代培养方法，其特征在于，其包括如下步骤： (1) 组织前处理：将结直肠癌组织经抗生素处理； (2) 切块； (3) 培养：将切好的组织块放入含抗生素的培养基中进行初期培养和正常培养，至细胞 贴壁。2. 根据权利要求1所述的低损伤的结直肠癌细胞原代培养方法，其特征在于，步骤（1) 将结直肠癌组织以无菌生理盐水冲洗，然后放入含抗生素的无血清培养基浸泡。3. 根据权利要求2所述的低损伤的结直肠癌细胞原代培养方法，其特征在于，所述含 抗生素的无血清培养基中抗生素为：500 U/mL青霉素，500 yg/mL链霉素，1.25 yg/mL 两性霉素B，80yg/mL庆大霉素。4. 根据权利要求1所述的低损伤的结直肠癌细胞原代培养方法，其特征在于，步骤 (2)切块为：将组织块放入细胞培养皿中，用无菌手术刀将组织切碎至体积l-50mm 3,优选 15-30mm3。5. 根据权利要求1所述的低损伤的结直肠癌细胞原代培养方法，其特征在于，步骤（3) 所述初期培养采用初期培养基，其含有：100 U/mL青霉素；100 y g/mL链霉素；0. 25 y g/ mL两性霉素B ;80 yg/mL庆大霉素；2mmol/L谷氨酰胺。6. 根据权利要求1所述的低损伤的结直肠癌细胞原代培养方法，其特征在于，步骤（3) 所述正常培养采用正常培养基，其含有：100 U/mL青霉素；100 y g/mL链霉素；0. 25 y g/ mL两性霉素B;2 mmol/L谷氨酰胺。
【专利摘要】本发明涉及一种低损伤的结直肠癌细胞原代培养方法，其包括如下步骤：（1）组织前处理：将结直肠癌组织经抗生素处理；（2）切块；（3）培养：将切好的组织块放入含抗生素的培养基中进行初期培养和正常培养，至细胞贴壁。本发明的方法对细胞损伤小、细胞存活率高、操作简便易培养。
【IPC分类】C12N5/09
【公开号】CN105154405
【申请号】CN201510647527
【发明人】赵增仁, 翟从劼, 张峰, 姜霞, 唐宇杰
【申请人】河北医科大学第一医院
【公开日】2015年12月16日
【申请日】2015年10月9日