用于实现治疗有效剂量的抗cd47剂的方法

用于实现治疗有效剂量的抗cd47剂的方法
【专利说明】用于实现治疗有效剂量的抗CD47剂的方法
【背景技术】
[0001] 细胞的更新开始于诱导标记它们W用于除去的细胞调亡程序或其它细胞变化，W 及通过吞隧细胞（包括巨隧细胞、树突细胞等）随后识别标志物。此过程要求不想要的细 胞的特异性和选择性除去。与健康细胞不同，不想要的/老化的/垂死细胞展示被称为"吃 我（eat-me)"信号即"改变自身"的标志物或配体，其进而可由吞隧细胞上的受体识别。健 康细胞可展示积极抑制吞隧作用的"别吃我"信号；运些信号在垂死细胞中下调、存在于改 变的构象中或它们优先于"吃我"或促吞隧信号的上调。健康细胞上的细胞表面蛋白CD47 W及其吞隧细胞受体SIRPa的接合构成可关闭由多种形式（包括调亡细胞清除和FcR介 导的吞隧作用）介导的吞入的关键"别吃我"信号。阻断CD47介导的吞隧细胞上的SIRPa 的接合或在敲除小鼠中的CD47表达的损失可引起活细胞和非老化红细胞的除去。对于其 中还存在预吞隧信号的那些细胞来说，阻断SIRPa还允许通常不被吞隧的祀标的吞入。
[0002]CD47是广泛表达的具有单个Ig样结构域和五个跨膜区的跨膜糖蛋白，其充 当SIRPa的细胞配体，其中结合通过SIRPa的N肥末端V样结构域介导。SIRPa主 要在骨髓细胞上表达，包括巨隧细胞、粒细胞、骨髓树突细胞值C)、肥大细胞W及它们 的前体，包括造血干细胞。SIRPa上介导CD47结合的结构决定簇由Lee等（2007) J.Immunol. 179:7741-7750;Hatherley等（2007)J.B.C. 282:14567-75 讨论；并且SIRPa 顺式二聚在CD47结合中的作用由Lee等（2010)J.B.C. 285:37953-63讨论。与CD47抑制 正常细胞的吞隧作用的作用一致，有证据表明它在临迁移期之前和在迁移期期间在造血干 细胞化SC)和祖细胞上瞬时上调，并且运些细胞上的CD47的水平决定它们在体内被吞入的 可能性。
[0003] 编程性细胞死亡（PCD)和吞隧细胞除去是生物体响应W便除去受损的、癌前或感 染的细胞的常见方式。因此，在此生物体响应情况下存活的细胞（例如，癌性细胞、长期感 染的细胞等）已经设计了用于逃避PCD和吞隧细胞除去的方式。CD47("别吃我"信号）在 各种各样的患病细胞、癌细胞W及受感染细胞上组成型上调，从而允许运些细胞逃避吞隧 作用。阻断一种细胞（例如，癌细胞、感染的细胞等）上的CD47与另一种细胞（例如，吞隧 细胞）上的SIRPa之间的相互作用的抗CD47剂抵消CD47表达的增加并且促进癌细胞和 /或受感染细胞的吞隧作用。因此，抗CD47剂可用于治疗和/或保护免受各种各样的病状 /病症。
[0004] 然而，初始高剂量的抗CD47剂可引起小鼠和非人灵长类动物（NH巧模型中的红细 胞（RBC)的剂量依赖性损失。运种贫血的严重性可排除实现与治疗功效相关的持续血清浓 度所要求的更高剂量的使用。本发明提供减轻抗CD47剂的红细胞毒性、从而能够用治疗有 效量的抗CD47剂治疗的方法。

【发明内容】

[0005] 提供用于通过在向个体施用治疗有效剂量的抗CD47剂之前施用引物剂来用治疗 剂量的抗CD47剂治疗所述个体的方法。在一些实施方案中，本发明的方法适用于优化针对 调节CD47介导的吞隧作用的疗法。在一些此类实施方案中，正在针对癌症用一定剂量的抗CD47剂治疗个体。在其它实施方案中，正在针对细胞内病原体感染用一定剂量的抗CD47剂 治疗个体。在主题方法中，在施用引物剂之后约3天至约21天施用治疗有效剂量的抗CD47 剂。
[0006] 在本发明的一些实施方案中，施用两种或更多种引物剂。适合的引物剂包括红细 胞生成刺激剂巧SA)和/或引发剂量的抗CD47剂。
[0007] 用于在本发明的方法中使用的抗CD47剂干扰存在于祀细胞（包括但不限于癌细 胞、感染细胞内病原体的细胞、干细胞等）上的CD47与存在于吞隧细胞上的SIRPa之间的 结合。通常运两种细胞均存在于所治疗的个体中。在促吞隧信号的存在下此类方法可增加 祀细胞的吞隧作用。主题方法可用于针对对CD47介导的SIRPa信号传导的阻断敏感的任 何疾病治疗受试者。适合的抗CD47剂包括可溶性SIRPa多肤；可溶性CD47 ;抗CD47抗体、 抗SIRPa抗体等，其中术语抗体涵盖抗体片段及其变体，如本领域中所已知。
[0008] 治疗剂量的如上所述的抗CD47剂可导致红细胞（RBC)的损失和贫血。本发明的 方法解决运一问题，并且出人意料地显示如本文所用的引物剂显著降低由于红细胞的损失 所致的毒性。不受理论束缚，据信引物剂增加网织红细胞（不成熟的RBC)的产生，其可更 耐CD47介导的吞隧作用并且因此在抗CD47剂的随后施用期间较不易于损失。
[0009] 本发明的某些实施方案任选地包括确定个体对施用引物剂的反应性的步骤。例 如，网织红细胞计数或血红蛋白的减少可用于确定施用引物剂是否增加网织红细胞的产 生。可在引物剂施用之前和之后进行网织红细胞计数，从而允许在有效于网织红细胞的增 加的计数之间的一段时间。任选地，可使用用于确定增加的红细胞生成的任何适合的方法。
[0010] 在施用引物剂并且允许有效于网织红细胞产生的增加的一段时间之后，施用治疗 剂量的抗CD47剂。治疗剂量可W多种不同方式施用。在一些实施方案中，在施用引物剂之 后施用两个或更多个治疗有效剂量。在一些实施方案中，治疗有效剂量的抗CD47剂作为递 增浓度的两个或更多个剂量施用，在其它实施方案中剂量是等效的。
【附图说明】
[0011] 图1 A-B呈现在单次250 yg腹膜内注射（IP injection)MIAP410(IgGl同种型） 或MIAP470(IgG2a同种型）施用至野生型小鼠之后血细胞比容（肥T)的变化百分比和血红 蛋白的变化百分比。
[0012] 图2呈现在单次250yg腹膜内注射MIAP410 (IgGl同种型）或MIAP470 (IgG2a同 种型）施用至CD47-/-小鼠之后血红蛋白的变化百分比。
[001引 图3A-B呈现在腹膜内注射250yg的对照小鼠IgG、MIAP410或MIAP740每3天 施用至野生型小鼠之后血细胞比容化CT)的变化百分比和血红蛋白的变化百分比。
[0014] 图4描绘在Ig-样细胞外结构域中人与雜猴CD47之间的序列比对。人 CD47ECD(SEQIDN0:4);食蟹猴（雜猴）CD47ECD(SEQIDN0:5)。
[0015] 图5证明化5F9-G4识别人和食蟹猴CD47，但不识别小鼠CD47。通过涂覆抗小鼠 Fc特异性抗体，接着添加人、小鼠和食蟹猴CD47-mFc融合蛋白来进行化ISA。不相关的小 鼠Fc(mFc)融合蛋白用作阴性对照。然后添加化5F9-G4。使用HRP缀合的抗人K抗体检 测结合的抗体。
[0016] 图6呈现针对化5F9-G4结合测量的结合常数的总结。使用GLM传感器忍片在 BioRadProte化XPR36系统上进行SPR结合研究。在25°C下收集结合数据。使用1:1相互 作用模型对反应数据全局拟合。括号中的数字表示最后一次报道的数字的标准误差。（A) 结合至人CD47。度）结合至食蟹猴CD47。
[0017] 图7呈现来自非人灵长类动物化5F9-G4毒理动力学研究的数据。通过所指示水 平下的单剂量对食蟹猴NHP施用化5F9-G4。（A)贫血W剂量依赖性方式发展，但自发消退。 阴影条表示指示人中对于输血的需要的血红蛋白的范围。度）通过测量血清水平的药代动 力学（PK)分析指示短的半衰期，其中治疗水平通过10和30mg/kg而不是其它剂量实现。
[0018] 图8呈现来自非人灵长类动物化5F9-G4剂量递增毒理动力学研究的数据。在剂 量递增研究中W所指示的剂量和时间点对未接受预处理或接受用单剂量的EP0预处理的 食蟹猴NHP施用化5F9-G4。（A)连续地测量血红蛋白W监测贫血。度）通过化ISA针对 化5F9-G4的水平筛选血清W确定药代动力学（PK)。在图（A)中，阴影条指示在人中倾向于 触发输血的血红蛋白的范围。在图度）中，阴影条指示与异种移植研究中的有效功效相关 的血清化5F9-G4的范围。
[0019] 图9呈现来自非人灵长类动物化5F9-G4负载-维持剂量毒理动力学研究的数据。 食蟹猴NHP在第1天接受Img/kg或3mg/kg的负载剂量（LD)(即，引发剂量），并且然后在 所指示的时间点接受10或30mg/kg的维持剂量（MD)。2种NHP(实线和虚线）用于每个实 验组中。（A)连续地测量血红蛋白W监测贫血。度）通过化ISA针对化5F9-G4的水平筛 选血清W确定药代动力学。在图（A)中，阴影条指示在人中可能触发输血的血红蛋白的范 围。在图度）中，阴影条指示与异种移植研究中针对原发性人AML的有效功效相关的血清 化5F9-G4的范围（即，治疗有效的血清水平的范围）。
[0020] 图10呈现证明与不同剂量的抗CD47剂（在此情况下hu5F9-G4抗体）相关的网 状细胞增多症的水平的网织红细胞计数数据。
[0021] 图11证明化5F9-G4抑制肿瘤生长和转移。A)化5F9-G4在异种移植测定中完全消 除膀脫癌。B)化5F9-G4体内预防人前列腺癌转移。
[002引 图12证明化5F9-G4消除已形成的转移。A-B)化5F9-G4消除肺（A)和脑做中的 转移性乳癌细胞。C)化5F9-G4抑制切除的乳腺肿瘤的再生长。D)hu5F9-G4的血清浓度与 治疗功效相关。因此，人源化抗体（例如hu5F9-G4)具有与疾病（例如，癌症或慢性感染） 的治疗相关的相同一般特性，因为当使用人源化抗体（例如，抗CD47抗体）治疗癌症和/ 或治疗慢性感染时非人源化抗体和主题方法将是有效的。
[0023] 图13描绘实施例4中所述的研究设计。
[0024]图14描绘在实施例4中所述的研究的持续时间内所有组的血红蛋白水平数据 (还参见图13)。
[00巧]图15描绘在实施例4中所述的研究的所有组中化5F9-G4 (人源化抗CD47抗体） 的药代动力学曲线（还参见图13)。
【具体实施方式】
[0026] 本发明设及通过首先施用引物剂用治疗剂量的抗CD47剂治疗受试者的方法。
[0027] 在描述本发明方法和组合物之前，应理解本发明不限于所描述的具体方法或组合 物，因为运些当然都可w变化。还应该理解，本文所使用的术语仅出于描述具体实施方案的 目的，并且不意图为限制性的，因为本发明的范围将仅由所附权利要求所限制。
[0028] 在提供数值范围时，应理解，还明确公开了该范围的上限与下限之间的各居中值 (至下限单位的十分之一，除非上下文另外明确地规定）。在规定范围中的任何规定值或居 中值与在该规定范围中的任何其它规定值或居中值之间的各个较小范围涵盖在本发明之 内。运些较小范围的上限和下限可被独立地包括在该范围中或排除在该范围外，并且当两 个界限之一、都不或全都包括在较小范围中时各个范围也涵盖在本发明内，从属于规定范 围中的任何明确排除的极限值。在规定范围包括限值之一或两者时，超出那些包括的限值 的任一者或两者的范围也包括在本发明中。
[0029] 除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与由本发明所属领 域中的普通技术人员通常理解的相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文 所述的那些类似或等效的任何方法和材料，但是现在描述一些可能和优选的方法和材料。 本文提及的所有出版物W引用的方式并入本文，W便公开和描述与所引述的出版物相关的 方法和/或材料。应理解的是，在有矛盾的情况下，本公开内容优先于所并入出版物的任何 公开内容。
[0030] 本领域技术人员在阅读本公开之后将显而易见的是，本文所述且说明的各个单独 实施方案具有分离的组分和特征，所述组分和特征可容易地与任何其它若干实施方案的特 征分离或组合而不偏离本发明的范围或精神。任何所陈述方法均可W所陈述事件的顺序或 W逻辑上可能的任何其它顺序进行。
[0031] 必须指出，除非上下文另外明确地规定，否则在本文和所附权利要求中使用的单 数形式"一个"、"一种"和"所述"包括复数指示物。因此，例如，提及"一个细胞"包括多个 此类细胞并且提及"所述肤"包括提及一种或多种肤及其本领域中的技术人员已知的等效 物（例如多肤）等。
[0032] 本文所讨论的出版物仅为其在本申请的提交日期之前的公开而提供。本文没有任 何内容应被解释为承认本发明没有资格先于现有发明的此类出版物。此外，所提供的公布 日期可与实际公布日期不同，运可能需要独立证实。
[0033] 定女
[0034] 抗CD47剂。如本文所用，术语"抗CD47剂"是指减少CD47 (例如，在祀细胞上）与 SIRPa(例如，在吞隧细胞上）的结合的任何剂。适合的抗CD47试剂的非限制性实例包括 SIRPa试剂，包括但不限于高亲和力SIRPa多肤、抗SIRPa抗体、可溶性CD47多肤W及抗 CD47抗体或抗体片段。在一些实施方案中，适合的抗CD47剂（例如抗CD47抗体、SIRPa 试剂等）特异性地结合CD47W减少CD47与SIRPa的结合。在一些实施方案中，适合的抗 CD47剂（例如抗SIRPa抗体、可溶性CD47多肤等）特异性地结合SIRPaW减少CD47与 SIRPa的结合。结合SIRPa的适合的抗CD47剂不会活化SIRPa(例如，在表达SIRPa的 吞隧细胞中）。适合的抗CD47剂的功效可通过测定剂来评定（下文进一步描述）。在示例 性测定中，在存在或不存在候选剂的情况下解育祀细胞。用于在本发明的方法中使用的剂 将使吞隧作用相较于在不存在所述剂的情况下的吞隧作用上调至少10% (例如至少20%、 至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少100%、至 少120%、至少140%、至少160%、至少180%或至少200%)。类似地，用于SIRPa的酪氨 酸憐酸化的水平的体外测定将显示憐酸化相较于在不存在候选剂的情况下观察到的憐酸 化降低至少5% (例如，至少10%、至少15%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、 至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或100% )。
[0035] 在一些实施方案中，抗CD47剂不会在结合之后活化CD47。当CD47被活化时， 可能发生类似于细胞调亡（即，编程性细胞死亡）的过程（Manna和化azier，Cancer 尺636曰'油，64，1026-1036,2004年2月1日）。因此，在一些实施方案中，抗〔047剂不会直 接诱导表达CD47的细胞的细胞死亡。
[0036] -些病原体（例如痘病毒、粘液瘤病毒、鹿痘病毒、猪痘病毒、山羊痘病毒、绵羊痘 病毒等）表达CD47类似物（即，CD47模拟物）（例如，M12化蛋白），所述CD47类似物充当 毒力因子W能够感染（Cameron等，Virology. 2005年6月20日；337(1) : 55-67)，并且一些 病原体诱导宿主细胞中的内源性CD47的表达。感染病原体的表达CD47类似物的细胞因此 可排他性地或与内源性CD47组合表达病原体提供的CD47类似物。运种机制允许病原体在 增加或不增加内源性CD47的水平的情况下增加感染的细胞中的CD47表达（通过表达CD47 类似物）。在一些实施方案中，抗CD47剂（例如抗CD47抗体、SIRPa试剂、SIRPa抗体、 可溶性CD47多肤等）可减少CD47类似物（即，CD47模拟物）与SIRPa的结合。在一些 情况下，适合的抗CD47剂（例如，SIRPa试剂、抗CD47抗体等）可结合CD47类似物（即， CD47模拟物）W减少CD47类似物与SIRPa的结合。在一些情况下，适合的抗CD47剂（例 如，抗SIRPa抗体、可溶性CD47多肤等）可结合SIRPa。结合SIRPa的适合的抗CD47剂 不会活化SIRPa(例如，表达SIRPa的吞隧细胞中）。当病原体是提供CD47类似物的病 原体时，抗CD47剂可用于本文提供的任何方法中。换言之，如本文所用，术语"CD47"涵盖 CD47W及CD47类似物（即，CD47模拟物）。
[0037] SIRPa试剂。SIRPa试剂包含SIRPa的足可识别的亲和力结合CD47的 部分，所述部分通常位于信号序列与跨膜结构域之间，或保留结合活性的其片段。适合的 SIRPa试剂减少（例如，阻断、防止等）天然蛋白质SIRP a与CD47之间的相互作用。SIRP a 试剂通常将至少包含SIRPa的dl结构域。在一些实施方案中，SIRPa试剂是融合蛋白， 例如，与第二多肤框内融合。在一些实施方案中，第二多肤能够增加融合蛋白的大小，例如 W使得融合蛋白将不会从循环中快速清除。在一些实施方案中，第二多肤是免疫球蛋白Fc 区的一部分或全部。Fc区通过提供"吃我"信号有助于吞隧作用，其增强由高亲和力SIRPa 试剂提供的"别吃我"信号的阻断。在其它实施方案中，第二多肤是大致上类似于Fc的任 何适合的多肤，例如，提供增加的大小、多聚化结构域和/或与Ig分子的另外结合或相互作 用。
[0038] 在一些实施方案中，主题抗CD47剂是"高亲和力SIRPa试剂"，其包括SIRPa源 性的多肤及其类似物。高亲和力513口〇试剂描述于国际申请口口'/1]513/21937中，其特此^ 引用的方式具体地并入。高亲和力SIRPa试剂是天然SIRPa蛋白的变体。在一些实施方 案中，高亲和力SIRPa试剂是可溶性的，其中多肤缺乏SIRPa跨膜结构域并且包含相对于 野生型SIRPa序列的至少一个氨基酸变化，并且其中氨基酸变化增加结合CD47的SIRPa 多肤的亲和力，例如通过使解离速率降低至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍、至 少500倍或更多。
[0039] 高亲和力SIRPa试剂包含SIRPa的足可识别的亲和力（例如高亲和力） 结合CD47的部分，所述部分通常位于信号序列与跨膜结构域之间，或保留结合活性的其片 段。高亲和力SIRPa试剂通常将至少包含SIRPa的dl结构域，具有修饰的氨基酸残基W 增加亲和力。在一些实施方案中，本发明的SIRPa变体是融合蛋白，例如，与第二多肤框内 融合。在一些实施方案中，第二多肤能够增加融合蛋白的大小，例如W使得融合蛋白将不会 从循环中快速清除。在一些实施方案中，第二多肤是免疫球蛋白化区的一部分或全部。Fc 区通过提供"吃我"信号有助于吞隧作用，其增强由高亲和力SIRPa试剂提供的"别吃我" 信号的阻断。在其它实施方案中，第二多肤是大致上类似于Fc的任何适合的多肤，例如，提 供增加的大小、多聚化结构域和/或与Ig分子的另外结合或相互作用。提供增加的亲和力 的氨基酸变化位于dl结构域中，并且因此高亲和力SIRPa试剂包含人SIRPa的dl结构 域，具有相对于dl结构域内的野生型序列的至少一个氨基酸变化。此类高亲和力SIRPa 试剂任选地包含另外的氨基酸序列，例如抗体Fc序列；野生型人SIRPa蛋白不同于dl结 构域的部分，包括但不限于天然蛋白质的残基150至374或其片段，通常与dl结构域邮连 的片段；等。高亲和力SIRPa试剂可W单体的或多聚体的，即二聚体、S聚体、四聚体等。
[0040] 抗CD47抗体。在一些实施方案中，主题抗CD47剂是特异性地结合CD47的抗体 (即，抗CD47抗体）并且减少一种细胞（例如，感染的细胞）上的CD47与另一种细胞（例 如，吞隧细胞）上的SIRPa之间的相互作用。在一些实施方案中，适合的抗CD47抗体不会 在结合之后活化CD47。适合的抗体的非限制性实例包括克隆B6H12、5F9、8B6和C3 (例如，如 描述于国际专利公布W0 2011/143624中，W引用的方式具体地并入本文）。适合的抗CD47 抗体包括此类抗体的完全人、人源化或嵌合型式。人源化抗体（例如hu5F9-G4)由于其低 抗原性尤其适用于人中的体内应用。类似犬源化、猫源化等抗体分别尤其适用于狗、猫和其 它物种中的应用。目标抗体包括人源化抗体，或犬源化、猫源化、马源化、牛源化、猪源化等 抗体及其变体。
[0041] 抗SIRPa抗体。在一些实施方案中，主题抗CD47剂是特异性地结合SIRPa的抗 体（即，抗SIRPa抗体）并且减少一种细胞（例如，感染的细胞）上的CD47与另一种细胞 (例如，吞隧细胞）上的SIRPa之间的相互作用。适合的抗SIRPa抗体可在不活化或刺激 通过SIRPa信号传导的情况下结合SIRPa，因为SIRPa的活化将抑制吞隧作用。相反，适 合的抗SIRPa抗体有助于遭受损伤的细胞相对于正常细胞的优先吞隧作用。相对于其它 细胞（未感染的细胞）表达更高水平的CD47的那些细胞（例如，感染的细胞）将优先地被 吞隧。因此，适合的抗SIRPa抗体特异性地结合SIRPa(而不活化/刺激足够的信号传导 反应来抑制吞隧作用）并且阻断SIRPa与CD47之间的相互作用。适合的抗SIRPa抗体 包括此类抗体的完全人、人源化或嵌合型式。人源化抗体由于其低抗原性尤其适用于人中 的体内应用。类似犬源化、猫源化等抗体分别尤其适用于狗、猫和其它物种中的应用。目标 抗体包括人源化抗体，或犬源化、猫源化、马源化、牛源化、猪源化等抗体及其变体。
[0042] 可溶性CD47多肤。在一些实施方案中，主题抗CD47剂是特异性地结合SIRPa的 可溶性CD47多肤并且减少一种细胞（例如，感染的细胞）上的CD47与另一种细胞（例如， 吞隧细胞）上的SIRPa之间的相互作用。适合的可溶性CD47多肤可在不活化或刺激通过 SIRPa信号传导的情况下结合SIRPa，因为SIRPa的活化将抑制吞隧作用。相反，适合的 可溶性CD47多肤有助于感染的细胞相对于未感染的细胞的优先吞隧作用。相对于正常、非 祀细胞（正常细胞）表达更高水平的CD47的那些细胞（例如，感染的细胞）将优先地被吞 隧。因此，适合的可溶性CD47多肤特异性地结合SIRPa，而不活化/刺激足够的信号传导 反应来抑制吞隧作用。
[0043] 在一些情况下，适合的可溶性CD47多肤可W是融合蛋白（例如，如结构性地描述 于美国专利公布US20100239579中，W引用的方式具体地并入本文）。然而，不会活化/刺 激SIRPa的仅融合蛋白适合用于本文所提供的方法。适合的可溶性CD47多