的休药期开始于第15天）。两只猴的T1/2在173至212小时的范围 内。
[0巧3] 总之，此研究中的处理相关作用与先前研究一致，并且包括血液学和临床化学参 数的变化。所有运些处理相关变化，包括在动物1037中观察到的严重贫血是可逆的，并且 到研究结束时返回至正常范围。此外，尽管所观察到的贫血，但在任一动物中未观察到毒性 的临床病征。
[0254] 食蟹猴中通过静脉内输注的化5F9-G4的8周毒性研究与8周恢复期
[0255] 此GLP研究的目的是当作为引发剂量、接着重复维持剂量施用至食蟹猴时评价 化5F9-G4的潜在毒性和毒理动力学。由于在先前研究中在动物编号1037中观察到的 5/150mg/kg的引发/维持剂量情况下的严重贫血，因此在此研究中使用的引发和最高维持 剂量是5/lOOmg/kg W为临床研究中建议的剂量提供合理的安全性界限。在第1天W 5mg/ kg作为引发剂量通过1小时静脉内输注施用媒介物或化5F9-G4(5mg/kg)，接着每周两次持 续连续7周施用的5、10、50或lOOmg/kg剂量的媒介物或化5F9-G4的维持剂量（第8、11、 15、18、22、25、29、32、36、39、43、46、50W及53天）。对于组5的引发和维持剂量采用相同 的剂量水平巧mg/kg)。恢复动物包括在媒介物和高剂量组中W评估任何处理相关作用的可 逆性。研究设计在表14中呈现。
[0巧6] 表14.食蟹猴中的8周毒理学研究
[0巧7]
[0巧引 A在第1天施用引发剂量，并且每周两次在第8、11、15、18、22、25、29、32、36、39、 43、46、50和53天施用维持剂量。
[0巧9] 安全药理学参数并入此研究中并且包括呼吸功能评估（视觉呼吸速率、屯、血管功 能巧CG)W及指示对中枢神经系统功能的作用的临床病征的变化（例如活动、行为）。在整 个研究期间收集血液样品W用于毒理动力学和评估ADA反应，W及评价CD47的受体占据。 在研究的整个持续时间，基于来自先前研究的数据对临床病理学样品进行评价W评估特异 性参数（例如，血红蛋白、RBC、网织红细胞）。在两只动物（动物编号3002;组3,引发/维 持剂量5/50mg/kg;动物编号4504 ;组4,引发/维持剂量5/lOOmg/kg)中观察到严重贫血， 并且将运些动物置于休药期W评价贫血的恢复和一旦重新给药，动物如何反应。动物编号 3002对于维持剂量6 - 9 (第25、29、32和36天）具有休药期，并且在第39天重新给药（维 持剂量10)。将动物编号4504在第25天（剂量6)置于休药期，并且继续休药期直到剂量 周期结束。主要研究动物在第57天终止并且恢复动物在第109天终止。研究的存活部分 是完整的，并且可获得主要研究动物的所有数据，包括组织病理学。来自恢复动物的数据将 在可获得时提义。
[0260] 在此研究中未发生计划外死亡，并且化5F9-G4的施用是临床上良好耐受的。未观 察到临床病征、体重、物理和眼科检查、体溫、ECG、呼吸或屯、率、凝血或尿分析参数、器官重 量或宏观和微观检查中的处理相关作用。
[0261] 与先前先导研究一致，在所有化5F9-G4处理组中观察到血液学参数的处理相关 变化并且包括红细胞质量（包括RBC计数、血红蛋白和血细胞比容）的轻度至中度降低，其 在第1天引发剂量之后最显著；血液学参数的运些变化显示到给药阶段结束时对于恢复的 持续倾向（关于血红蛋白水平的变化参见表15)。虽然在所有化5F9-G4处理组中观察到 RBC计数、血红蛋白和血细胞比容的减少，但运些变化不W明显剂量依赖性方式发生。在所 有化5F9-G4处理组中观察到网织红细胞的增加，指示与RBC质量的降低相关的稳健红细胞 生成反应。与先前研究一致，降低的红细胞质量与MCV和结合珠蛋白的减少W及MCHC、网 织红细胞和畑w的增加相关。未在任何剂量组中观察到游离血浆血红蛋白。还观察到淋己 细胞的最小至轻度增加，但运些增加在本质上是瞬时且偶发的并且不W剂量依赖性方式发 生。在第8天观察到血小板的最小至轻度增加（对于大多数组，其是相较于对照统计上显著 的），但到第11天在大多数组中开始返回至对照值。血小板的运种增加被认为是对加速的 红细胞生成的反应性血小板生成和生理反应，其是通过网织红细胞的同时增加明显的。血 液学参数的所有运些处理相关的变化到给药期结束时是部分或完全可逆的。
[0262] 表15.血红蛋白水平的变化
[0263]
[0264]
[0265]
[0266]
[0267]
[026引
[0269]
[0270] 虽然在第1天施用引发剂量之后血红蛋白在所有化5F9-G4处理的动物中减少，但 血红蛋白的减少通常在第8天施用第一维持剂量之后最显著（参见表16中的第11天血 红蛋白水平）。血红蛋白减少的程度在动物之间变化，在第11天具有《10.OgML的血红 蛋白水平的动物的发生率对于组2(2/10mg/kg)、组3巧/50mg/kg)、组4巧/lOOmg/kg)和组 5(5/5mg/kg)分别是67%、30%、90%和50%。虽然贫血（在第11天）在组2、3或5之间 不W明显剂量依赖性方式发生，但组4具有最高数目的具有《10.OgML的血红蛋白水平的 动物。总体上，在动物之间观察到血红蛋白的恢复的持续倾向，在约第15至32天开始且持 续直到研究结束。然而，在接近研究结束时注意到一个例外，其中动物编号3602在第46天 在施用第11个维持剂量之后具有血红蛋白的另一次明显减少（在第55和57天血红蛋白 降低至7.Og/化；表16)。然而，动物编号3602的血红蛋白水平开始在第60天（在最后一 个维持剂量之后7天）恢复，并且到第109天研究结束时返回至研究前水平（13. 4gAlL)。 由于所观察到的严重贫血，将两只动物（动物编号3002 ;组3,引发/维持剂量5/50mg/kg; 动物编号4504 ;组4,引发/维持剂量5/lOOmg/kg)置于休药期W评价贫血的恢复和一旦重 新给药，动物如何反应。动物编号3002显示更严重的贫血（在第15和18天低至5. 7g/化） 并且对于维持剂量6 - 9 (第25、29、32和36天）具有休药期；在第39天重新给药（维持剂 量10)。将动物编号4504在第25天（剂量6)置于休药期，并且继续休药期直到剂量周期 结束（参见表16W观察血红蛋白水平的变化）。在动物编号3002中注意到的RBC计数、血 红蛋白和网织红细胞的变化在第36天开始恢复，并且持续恢复直到在第57天研究结束。同 样，动物编号4504中的血液学变化开始恢复，并且显示恢复的持续倾向直到研究结束（第 109天；此动物处于恢复组中）。因此，虽然看起来较低数目的动物可能对由化5F9-G4产生 的贫血尤其敏感，但贫血是瞬时的且血红蛋白水平随时间推移恢复。
[0271] 表16.置于休药期的动物的血液学参数
[0272]
[0273] A在第25天将动物编号3002置于休药期且在第39天重新给药；主要研究动物且 在第57天终止
[0274] B在第25天将动物4504置于休药期且保持休药期直到研究结束；恢复动物且在第 109天终止
[0275] *基于测试机构的历史数据库显著低于食蟹猴的正常范围
[0276] 血细胞形态的变化与先前研究一致，并且被认为与加速的红细胞破坏/清除和 增加的红细胞生成相关。运些变化在本质上在从最小至显著的范围并且包括红细胞大小 不均、球形红细胞（小红细胞）、多染色性，W及与红细胞损伤/清除一致的偏屯、性细胞 (eccentrocytes)和非典型红细胞碎片。红细胞大小范围中的可变性是由于较小球形红细 胞与较大多染色性细胞（网织红细胞）的混合物。还在几个化5F9-G4处理的动物的循环 中观察到有核红细胞的数目的瞬时增加。红细胞形态的变化显示恢复的持续倾向直到研究 结束。骨髓涂片评价的变化是轻度至中度并且限于红细胞谱系的形态变化（发育异常），其 包括具有异常核形状、多核、核起泡和/或核至细胞质成熟不同步（异常核至细胞质成熟） 的偶然细胞。另外变化被认为同与HU5F9-G4相关的加速的红细胞生成反应有关，其包括组 3和组4(仅雌性）动物中的平均M:E比例的轻度降低连同适当的最小至轻度转移至与加速 的红细胞生成相关的更不成熟的红细胞前体。
[0277] 与先前研究一致，血液学参数的治疗相关变化（即，减少的RBC和血红蛋白；增加 的网织红细胞）与总胆红素的增加和结合珠蛋白的减少相关。仅在高剂量组巧/lOOmg/kg) 中观察到临床化学参数的其它变化并且包括白蛋白的轻微减少（两只雌性动物）、球蛋白 的轻微增加W及白蛋白：球蛋白比例的相应减少。临床化学参数的所有处理相关的变化在 给药期结束时是部分或完全可逆的。
[027引第8天毒理动力学显示在第1天的5mg/kg引发剂量和在第8天的5、10、50或lOOmg/kg初始维持剂量之后，Cmax的增加是10至lOOmg/kg成比例的剂量，但大于5至 lOOmg/kg成比例的剂量。虽然AUC0-72的增加倾向朝向50与lOOmg/kg之间成比例的剂 量，但AUC0-72的变化大于5至100或10至lOOmg/kg成比例的剂量。平均T1/2似乎随着 增加的剂量而增加并且在5mg/kg下6小时至在lOOmg/kg下52小时的范围。在暴露方面 不存在明显的性别差异。第25天毒理动力学显示W 5、10、50或lOOmg/kg每周两次给药持 续3周之后，暴露的增加（Cmax，AUC0-72)大于5至lOOmg/kg成比例的剂量但10至lOOmg/ kg成比例的剂量。此外，相较于雄性猴，暴露倾向于在雌性中更低。表观T1/2相对于更高 剂量在5mg/kg下更短。在一些动物中，T1/2在第25天与第8天之间类似，并且在其它动 物中，T1/2似乎在第25天更长；平均T1/2在6.3小时巧mg/kg)至66小时（50mg/kg)的 范围内。W 5、10、50或lOOmg/kg每周两次给药持续7周之后的第53天毒理动力学显示暴 露的增加（Cmax，AUC0-72)大于5至lOOmg/kg成比例的剂量但10至lOOmg/kg成比例的剂 量。
[0279] 相对于第25天或第8天在第53天的浓度对比时间曲线表明化5F9-G4的循环浓度 随着重复给药持续增加。除了 5mg/kg剂量（其似乎受ADA影响）之外，每个剂量组内在第 53天的平均和中值暴露（Cmgy，AUC。72)通常高于在第25天或第8天的平均和中值暴露，从而 表明在持续每周两次给药情况下的化5F9-G4进一步积聚。虽然ADA的发展似乎影响暴露， 但此影响主要在5mg/kg维持剂量下注意到，并且总体上暴露在整个研究中维持在>lOmg/ kg维持剂量的剂量下。
[0280] 总之，处理相关的发现与先前研究一致，并且包括血液学和临床化学参数W及骨 髓细胞学的变化。血液参数的变化包括RBC计数和血红蛋白与网状细胞增多症组合的减 少。重要的是，在整个研究中未在任何动物中检测到游离血浆血红蛋白。虽然与化5F9-G4 相关的贫血在组2、3或5之间不W明显剂量依赖性方式发生，但具有《10.0 gML的血红蛋 白水平的动物的数目在组5中最高，其被施用最高维持剂量（lOOmg/kg)。虽然血红蛋白水 平通常显示在约第15 - 32天开始在所有动物中恢复的倾向并且持续到研究的结束，但在 第46天施用第11个维持剂量之后接近研究结束时在一只动物（组3)中再次注意到血红 蛋白的显著减少。然而，此动物的血红蛋白到研究结束时（第109天）返回至研究前水平。 由于在每只动物中观察到的严重贫血，将两只动物（组3和4中各一只）置于休药期。重 要的是，尽管在运些动物中观察到的严重贫血，但未注意到毒性的临床病征且每只动物中 的血红蛋白水平显示恢复的持续倾向直到研究结束。红细胞形态的变化与加速的红细胞破 坏/清除和增加的红细胞生成一致，并且包括非典型红细胞碎片、红细胞大小不均、球形红 细胞（小红细胞）W及多染色性。血液学参数的变化与增加的总胆红素和减少的结合珠蛋 白相关。仅在高剂量组中注意到临床化学参数的其它处理相关变化并且包括白蛋白的轻微 减少、球蛋白的轻微增加W及相应的白蛋白：球蛋白（A:G)比例。所有运些处理相关的变 化到研究结束时在所有化5F9-G4处理组中是部分或完全可逆的。骨髓细胞学的变化限于 红细胞谱系的形态变化，其包括具有异常核形状、多核、核起泡和/或核至细胞质成熟不同 步的偶然细胞。
[0281] 总体上，在第1周（第1天）W 5mg/kg的引发剂量通过1小时静脉内输注、接着 在多达lOOmg/kg的剂量下每周两次维持剂量持续连续7周施用化5F9-G4在食蟹猴中是临 床上良好耐受的。尽管处理相关的贫血，包括具有休药期的动物，但未观察到临床毒性的病 征。在此研究中观察到的变化与先前研究一致，并且认为与化5F9-G4在通过结合RBC上表 达的CD47加速老化RBC消除的过程中的药理作用相关。因此，基于数据的总体，此研究的 最高非严重毒性剂量（HTNSTD)认为是5/lOOmg/kg的引发/维持剂量，所评价的最高剂量。
[0282] 遗传毒性
[0283] 针对小分子药物产品常规进行的遗传毒性研究的范围和类型通常不适用于生物 技术来源的产品[ICHS6巧1)]。不预期单克隆抗体如化5F9-G4将与DNA或其它染色体物 质直接相互作用。因此，认为诱变性研究是不适当的且未计划。
[0284] 致癌性
[0285] 未用化5F9-G4进行致癌性研究。基于化5F9-G4的作用机制，它不被预期是致癌 性的。另外，化5F9-G4既不是生长因子也不是免疫抑制剂。因此，鉴于所意图的患者群体 和机制关注的缺乏，未计划致癌性研究。
[0286] 生殖和发育毒性
[0287] 未用化5F9-G4进行生殖和发育毒性研究。虽然将不会进行正式、独立的生育力研 究，但在8周毒性研究中未在雄性和雌性生殖器官的微观检查中注意到处理相关作用。因 为实验室动物中化5F9-G4的潜在致崎作用（如果存在）是未知的，所W化5F9-G4将不被 施用至孕妇。为了避免怀孕，将对招募进入建议的1期临床研究中的具有生育潜力的男性 和女性患者采取适当的预防措施（例如，女性必须证明妊娠测试阴性，患者必须同意适当 的避孕预防措施等）。
[028引局部耐受性
[0289] 未进行独立的局部耐受性研究；然而，与ICHS6巧1) 一致，作为重复剂量毒性研 究的一部分进行化5F9-G4的局部耐受性的评价（临床观察结果、来自注射部位的组织样品 的宏观和微观检查）。
[0290] 讨论和结论
[0291] 在所提出的临床试验中进行了支持施用化5F9-G4的一系列全面的毒理学研究。 运些研究包括体外溶血研究、在雜猴和食蟹猴中的单剂量和多剂量研究W及在一组人组织 中的组织交叉反应性研究。
[0292] 在所有猴研究中的主要和一致的处理相关发现是贫血（如在减少的RBC计数和血 红蛋白中所反映）。贫血通常在施用第一剂量（或在引发/维持剂量方案研究中的引发剂 量）之后发展并且与指示加速的RBC清除和反应性红细胞生成的变化相关，包括网状红细 胞增多症和RBC形态的改变如红细胞大小不均、多染色性和球形红细胞症。重要的是，在所 有研究中未观察到游离血浆血红蛋白。与化5F9-G4相关的血液学参数的变化通常与结合 珠蛋白和总胆红素的变化相关；结合珠蛋白经常但并不总是减少，并且通常观察到总胆红 素的增加；然而，结合珠蛋白和总胆红素的变化不W剂量依赖性方式发生。在所有研究之 中，与化5F9-G4相关的血液学和临床化学参数的变化显示在研究期间恢复的倾向，并且到 研究结束时是部分或完全可逆的。认为骨髓细胞学的变化（在GLP8周研究中进行；PR013) 与加速的红细胞生成相关并且包括红细胞谱系的形态变化、平均M:E比例的降低W及适当 的转移至与加速的红细胞生成相关的更不成熟的红细胞前体。
[0293] 基于CD47在老化红细胞的正常清除中的已知作用和在猴研究中获得的合并数 据，认为主要的处理相关变化（即，贫血）与结合RBC上表达的CD47的化5F9-G4的药理作 用相关。相信施用化5F9-G4通过用CD47对老化RBC的立即阻断取代CD47的逐渐损失来 加速消除老化RBC的过程。老化RBC的过早损失通过确保网状细胞增多症（其在所有研究 中观察到）进行补偿，并且随时间推移，随着老化RBC被更年轻的细胞替代，初始贫血消退， 并且因此，RBC池的年龄分布转变成更年轻的细胞。
[0294] 尽管与施用化5F9-G4相关的贫血，但未在任何动物中的临床病征中观察到毒性 的证据，并且因此化5F9-G4是临床上良好耐受的，即使在高达300mg/kg的剂量下。虽然施 用化5F9-G4导致瞬时贫血，但未注意到毒性的临床病征，并且化5F9-G4由猴临床上良好耐 受，即使在高达300mg/kg的剂量下。然而，毒性研究确实掲示较小数量的动物对化5F9-G4 相关的贫血特别敏感。虽然此时未知运些猴对由化5F9-G4产生的贫血更敏感的原因，但贫 血是瞬时的并且一致地显示在终止给药之后恢复的倾向。因为某些患者可能比其它患者更 敏感，所W将在所提出的临床研究中严密地监测血液学的变化，并且将针对发展低于预先 指定水平的贫血的任何患者采取适当的措施。
[0295] 与化5F9-G4相关的贫血在所有猴研究中是部分或完全可逆的，并且对于置于休 药期的动物来说消退，包括已经重新给药的那些动物。8周毒理学研究的HNSTD是5/lOOmg/ kg的引发/维持剂量（所测试的最高剂量）。基于毒理动力学数据，用于8周毒理学研究 的5mg/kg引发剂量预计提供在高于所计划的临床试验中所提出的0.Img/kg的起始引发剂 量的28至194倍范围内的安全性界限（基于AUC的）。lOOmg/kg的每周两次维持剂量提 供在高于针对所提出的临床研究所计划的0.Img/kg的起始维持剂量766-803倍范围内的 预测安全性界限（基于AUC)。
[0296]总之，基于来自毒理学研究的结果，非临床安全性评估程序支持针对所提出的临 床试验施用化5F9-G4 (例如，如静脉内输注）。
【主权项】
1. 一种用治疗剂量的抗CD47剂治疗受试者的方法，所述方法包括： (a) 向所述受试者施用第一引物剂；以及 (b) 向所述受试者施用治疗有效剂量的抗CD47剂， 其中步骤（b)在开始步骤（a)之后至少约3天之后进行。2. 根据权利要求1所述的方法，其中，步骤（b)在开始步骤（a)之后约3天至约21天 的范围内进行。3. 根据权利要求1所述的方法，其中所述第一引物剂包含选自由以下组成的组的剂： 红细胞生成刺激剂（ESA)、引发剂量的所述抗⑶47剂、引发剂量的第二抗⑶47剂及其组合。4. 根据权利要求3所述的方法，其中所述第一引物剂包含ESA。5. 根据权利要求1所述的方法，步骤（b)在开始步骤（a)之后约6天至约8天的范围 内进行。6. 根据权利要求1所述的方法，其进一步包括在步骤（a)之后且在步骤（b)之前：确 定施用所述引物剂是否有效的步骤。7. 根据权利要求6所述的方法，其中所述确定步骤包括进行网织红细胞计数，其中施 用所述引物剂确定为在所述网织红细胞计数是约400XIO9个网织红细胞/升（L)或更多 的情况下一直是有效的。8. 根据权利要求6所述的方法，其中所述确定步骤在开始步骤（a)之后约3天至约12 天的范围内进行。9. 根据权利要求1所述的方法，其进一步包括在步骤（a)之后且在步骤（b)之前：将 第二引物剂施用至所述受试者。10. 根据权利要求9所述的方法，其中所述第一引物剂包含选自由以下组成的组的剂： 红细胞生成刺激剂（ESA)、引发剂量的所述抗⑶47剂、引发剂量的第二抗⑶47剂及其组合。11. 根据权利要求10所述的方法，其中： 所述第一引物剂包含红细胞生成刺激剂（ESA);以及 所述第二引物剂包含选自由以下组成的组的剂：引发剂量的所述抗CD47剂、引发剂量 的第二抗⑶47剂及其组合。12. 根据权利要求1所述的方法，其中步骤（b)包括在两个或更多个递增浓度的剂量中 施用所述抗CD47剂直到施用治疗有效剂量。13. 根据权利要求1所述的方法，其中步骤（b)包括施用两个或更多个治疗有效剂量。14. 根据权利要求1所述的方法，其包括向所述受试者施用治疗有效剂量的两种或更 多种抗CD47剂。15. 如权利要求1所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物。16. 如权利要求15所述的方法，其中所述哺乳动物是人。17. 如权利要求1所述的方法，其中所述受试者具有癌症或细胞内病原体感染。18. 如权利要求1所述的方法，其中所述抗CD47剂特异性地结合CD47。19. 如权利要求18所述的方法，其中所述抗CD47剂是抗体。20. 如权利要求18所述的方法，其中所述抗⑶47剂是SIRPa试剂。21. 如权利要求1所述的方法，其中所述抗CD47剂特异性地结合SIRPa并且不会在结 合之后活化⑶47。22. 如权利要求21所述的方法，其中所述抗CD47剂是抗体。23. 如权利要求21所述的方法，其中所述抗CD47剂是可溶性CD47多肽。24. -种试剂盒，其包括：用于在如权利要求1-23中任一项中提出的方法中使用的引 物剂和抗⑶47剂。
【专利摘要】本文提供用于通过在向受试者施用治疗有效剂量的抗CD47剂之前施用引物剂来用治疗剂量的抗CD47剂治疗所述受试者的方法。细胞的更新开始于诱导标记它们以用于除去的细胞凋亡程序或其它细胞变化，以及通过吞噬细胞(包括巨噬细胞、树突细胞等)随后识别标志物。此过程要求不想要的细胞的特异性和选择性除去。
【IPC分类】C07K16/28
【公开号】CN105189556
【申请号】CN201480015159
【发明人】斯蒂芬·威林汉, 莫林·霍华德, 杰·刘, 莱文德拉·吗杰提, 苏珊·斯威尼·普劳哈斯卡, 安妮·K·沃奥科迈, 詹斯·彼得·沃奥科迈, 欧文·L·唔斯曼
【申请人】小利兰·斯坦福大学托管委员会
【公开日】2015年12月23日
【申请日】2014年2月26日
【公告号】CA2903773A1, EP2970493A1, US20160008429, WO2014149477A1, WO2014149477A8