一种人源抗创伤弧菌溶血素蛋白(vvh)抗体的制备方法与应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体设及一种人源抗创伤弧菌溶血素蛋白（WH)抗体 的制备方法与应用。
【背景技术】
[0002] 创伤弧菌是近海海域致病性较为突出的一种人鱼共患致病弧菌，天然存在于近海 海水及海生动植物中，可经胃肠道粘膜或皮肤开放性创口进入人体，导致蜂窝织炎、脈毒 性休克、多器官衰竭等严重的感染症状，即使用抗生素积极治疗，仍有很高的死亡率（> 50% )，因此对人体的健康乃至生存W及海洋渔业等都有极大危害。目前国内外针对创伤弧 菌的治疗仍W抗生素传统治疗方法为主，耐药菌株的出现W及药物残留等问题，使得生物 治疗新方法的研究成为当前热点，特别是近年来，W单克隆抗体为基础的抗感染免疫治疗 研究进展迅速，也使得针对创伤弧菌的抗体免疫治疗已成为现代生物制药的重要内容。
[0003] 创伤弧菌的致病性与多种毒力因子相关，其中创伤弧菌溶血素（WH)是一种公 认的由创伤弧菌结构基因vvM编码的致病因子，是创伤弧菌侵袭人体时释放至胞外的唯 一的一种胞膜穿孔毒素，可W诱导哺乳动物细胞发生坏死、调亡，在致病过程中发挥关键作 用。目前已研制出针对WH的检测用抗体制剂，针对创伤弧菌毒素蛋白、非金属蛋白酶、外 膜蛋白等毒力因子中和性抗体也已问世，可在一定程度上有效治疗感染致死量创伤弧菌的 小鼠，提高生存率，且部分抗体疫苗已应用于海洋渔业中鱼病的防治，并已取得较好的防治 效果。但迄今运些创伤弧菌中和抗体均是鼠源或其它动物源性，属于人体异源蛋白，易使人 体产生异源抗原免疫反应，因而限制了其进一步在人体内的应用。而高亲和力、高抗菌活性 的人源化抗体的研制则在很大程度上弥补了运种缺陷，现已成为未来抗感染生物治疗的主 要发展方向。
[0004] 隧菌体抗体库技术是目前生产全人源化抗体的最主要方法，它能够将全套抗体基 因展示在隧菌体表面，并在体外模拟抗体免疫系统的选择作用，对呈现在隧菌体表面的抗 体在体外用固相化抗原进行筛选。隧菌体展示技术实现了人源抗体制备技术的重大突破， 即不需要免疫动物和细胞融合，可利用抗原直接筛选所需基因。利用抗体库筛选技术，目前 已有针对多种细菌（如抗肺炎链球菌、结核杆菌、鼠疫杆菌、肺炎克雷伯菌等）及病毒（如 呼吸道冠状病毒、登革热病毒等）的ScFv人源单链抗体问世，但尚未见到抗创伤弧菌人源 化抗体的研究报道。
【发明内容】
阳0化]本发明的一个目的是提供一种抗创伤弧菌WH的抗体。
[0006] 本发明提供的抗创伤弧菌WH的抗体包括轻链可变区和重链可变区；所述重链可 变区的氨基酸序列为序列表中序列1的自氨基末端第135-260位氨基酸残基，所述轻链可 变区的氨基酸序列为序列表中序列1的自氨基末端第1-113位氨基酸残基。
[0007] 上述抗体中，所述抗创伤弧菌WH的抗体为人源抗创伤弧菌WH的抗体，所述抗创 伤弧菌WH的抗体为单链抗体。
[0008] 上述抗体中，所述抗体为如下1)或2)所示的蛋白质： 阳009] 1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0010] 2)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或 缺失和/或添加且具有相同功能的由1)衍生的蛋白质。
[0011] 本发明的另一个目的是提供上述抗体的编码DNA分子。
[0012] 本发明提供了上述抗体的重链可变区的核巧酸序列为序列表中序列2的第 405-780位核巧酸分子；所述抗体的轻链可变区的核巧酸序列为序列表中序列2的第1-339 位核巧酸分子。 阳01引上述编码DNA分子中，所述编码DNA分子为如下1)-扣中任一所述的DNA分子：
[0014] 1)其核巧酸序列是序列表中的序列2 ;
[0015] 2)在严格条件下可与序列表中序列2限定的DNA分子杂交且编码上述抗体的DNA 分子；
[0016] 3)与1)的DNA分子具有90%W上的同源性且编码上述抗体的DNA分子。
[0017] 本发明还有一个目的是提供含有上述编码DNA分子的重组表达载体或表达盒或 转基因细胞系或重组菌。
[0018] 上述抗体在如下a)-d)中任一种中的应用也属于本发明的保护范围：
[0019]a)制备特异性结合创伤弧菌VVH的产品；
[0020]b)制备特异性结合游离的VVH抗原的产品；
[0021] C)制备治疗或辅助治疗创伤弧菌的产品；
[0022] d)作为创伤弧菌疫苗。
[0023] 本发明的最后一个目的是提供一种治疗或辅助治疗抗弧菌感染的产品。
[0024] 本发明提供的治疗或辅助治疗抗弧菌感染的产品的活性成分为上述抗体。
[00巧]上述应用或上述抗体中，所述产品为药物。
[00%] 本发明选择创伤弧菌向胞外释放的唯一的细胞毒素WH为祀抗原，利用天然大容 量人源隧菌体抗体库筛选技术制备的人源抗创伤弧菌WH抗体，其抗体结构与种类与现有 报道的创伤弧菌检测及治疗性抗体不相同，该抗体特点是具有较高的中和创伤弧菌WH的 能力，与国内外现有抗体比较，此抗体为完全人源抗体，从理论上讲不会诱发明显过敏反 应；且体内循环半衰期短、穿透力强，不会像抗生素类药品有残留污染，在创伤弧菌感染的 治疗中具有广阔的应用前景。
【附图说明】 阳027] 图1为不同抗VVH隧菌体抗体与游离抗原的竞争抑制率。
[0028] 图2为抗WH隧菌体抗体的中和活性。
【具体实施方式】
[0029] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0030] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。 W31] 下述实施例中的原始隧菌体抗体库在文献"乔媛媛，王谈，陈晓穗，王 欲晓，化冰.大容量隧菌体抗体库的构建及鉴定，中华微生物学和免疫学杂 志，2004, 24 (3)，194-197.中国人民解放军海军总医院"中公开过，公众可从中国人民解放 军海军总医院获得。
[0032] 下述实施例中的BS1365细胞在文献"王谈，王欲晓，陈晓穗，化冰，刘晓林，用 于大容量隧菌体抗体库的表达载体的构建及鉴定，中国免疫学杂志，2003, 19 (2)，93-96. 中国人民解放军海军总医院"中公开过，公众可从中国人民解放军海军总医院获得。
[0033] 下述实施例中的大肠杆菌皿2151在文献"王谈，刘群英，化冰，陈宇萍，朱迎春， 陈晓穗，从半合成抗体库克隆抗TNF-a人单链抗体，免疫学杂志，1999, 15(4) : 87-89." 中公开过，公众可从中国人民解放军海军总医院获得。
[0034] 下述实施例中的用于筛选的WH抗原在文献"魏杰，郭建巍，马驢等.创伤弧菌 溶血素基因的高效表达与鉴定.第四军医大学学报，2008, 29(14) : 1249-1252."和文献"付 凯飞，马驢，郭建巍等.抗创伤弧菌单克隆抗体杂交瘤细胞系的建立及初步鉴定.细胞与分 子免疫学杂志，2012, 28 (3) : 279-281."中公开过，公众可W从海军总医院检验科获得。
[0035] 下述实施例中的超级营养肉汤（Superbroth,SB)培养液的溶剂为水，溶质及其在 SB培养液中的浓度为：膜蛋白腺30g/l，酵母粉20g/l，3-(N-吗嘟代）丙横酸lOg/L。
[0036]实施例1、抗VVH抗体的制备方法 阳037] -、大容量人源隧菌体抗体库的制备
[0038]参考文献"SblatteroD,Bradbury A. Exploiting recombination in single bacteria to make large phage antibody libraries. Nat Biotechnol,2000;18:74. "中 的方法制备大容量人源隧菌体抗体库，具体步骤如下：
[0039] 1、从原始隧菌体抗体库中取出7 X l〇i2c化（克隆形成单位）的隧菌体颗粒超感染 BS1365细胞，感染复数（multiplicityofinfection,M0I为100/1，具体步骤参照文献"王 谈，王欲晓，陈晓穗，化冰，刘晓林.用于大容量隧菌体抗体库的表达载体的构建及鉴 定，中国免疫学杂志，2003, 19 (2) ,93-96."中的方法，37°C水浴lh，W使多副本载体进入同 一细胞，通过cre-loxp介导的定位重组使同一细胞内不同载体之间的轻、重链随机交换配 对，得到感染体系。 W40] 2、向上述步骤1的感染体系中加入含氨节青霉素（lOOug/mU的2XYT培养液（溶 剂为水，溶质及其在培养液中的质量分数为：蛋白腺1.6%的、酵母提取物1%的和氯化钢 0. 5% )至400血，37°C振荡培养至对数生长期（0D= 0. 5)。 阳0川 3、向步骤2培养后的感染体系中加入5ml辅助病毒VCSM13(p化=1.7Xl〇i2) (MerckST200251)，30°C低溫诱导培养过夜，次日离屯、上清，阳G8000(购自Promege公 司）回收沉淀，并测定隧菌体滴度，再WM0I《1的比例感染对数生长期的化1-Blue菌 (1000ml) (Stratagen,货号：200228)，37°C静止 30min。
[0042] 4、取10y1铺于含氨节青霉素的培养盘计算库容，加入氨节青霉素使其终浓度为 lOOg/ml，再加入10ml辅助隧菌体VCSM13(pfu= 1. 7X1〇i2)，30°C低溫诱导培养过夜，次日 回收上清，PEG8000回收沉淀，获得大容量重组隧菌体抗体工作库（大容量人源隧菌体抗体 库），并计算大容量重组隧菌体抗体工作库的库容和滴度。
[0043] 结果表明：大容量人源隧菌体抗体库的库容为7X1〇1°，滴度为3Xl〇i2c化/ml。 W44] 二抗WH隧菌体抗体的筛选、制备及ELISA检测 W45] 1、抗VVH隧菌体抗体的筛选
[0046] 抗VVH隧菌体抗体的筛选参照文献"王谈，刘群英，化冰等.从人源性隧菌体抗体 库分离出1株含有异常序列的抗皿sAgF油克隆.中国免疫学杂志，1998,14(1): 115-119." 和文献"王欲晓，乔媛媛，周丽君等.从大容量抗体库中筛选抗TNF-a人单链抗体.细胞与 分子生物学杂志，2008, 24巧）：878-880."中的方法。具体步骤如下：
[0047](1)将VVH抗原用0. 05mol/L的碳酸盐缓冲液肿9. 6)稀释至50 y g/ml，得到VVH 抗原溶液。
[0048] (2)取1mlWH抗原溶液包被免疫管，4°C过夜，用2. 5%的脱脂奶粉封闭化，加入 1ml上述步骤一制备的大容量人源隧菌体抗体库（约3Xl〇i2c化），37°C解育化。 W例 做用PBST将步骤似的产物洗涂15次（第2-4轮洗涂20次W上），蒸馈水洗 涂1次，然后加入1ml新鲜的化1-Blue菌直接感染，37°C解育15min，再转入10ml超级营养 肉汤（Superbroth,SB)培养液（含20yg/ml氨节青霉素）中。
[0050] (4)向步骤做的产物中加入1ml甘氨酸洗脱缓冲液（0.Imol/L肥1，甘氨酸调抑 值至2.