食碱戈登氏菌yc-rl2及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及微生物学及生物降解领域，具体地说，设及食碱戈登氏菌YC-化2及其 应用。
【背景技术】
[0002] 邻苯二甲酸醋（PhthalateAcidEsters,简称PAEs)是一类重要的工业原料，被 广泛用于塑料、农药、化妆品、油漆、橡胶等行业，它具有致癌致崎致突变和生殖发育毒性等 多种毒性，可通过多种途径进入环境，由此引起的环境问题得到世界的普遍关注。由于人 类对邻苯二甲酸醋的大量使用，使它们通过不同的途径进入大气、±壤、水环境，对生物圈 造成了不同程度的污染。PAEs与我们的日常生活密切相关，可W通过呼吸、饮食、饮水和皮 肤接触进入人体，对人体的健康产生不同程度的危害。常见的有邻苯二甲酸二（2-乙基已 基）醋值EHP)、邻苯二甲酸二环己醋值CHP)、邻苯二甲酸二甲醋值MP)、邻苯二甲酸二正 下醋值BP)、邻苯二甲酸二乙醋值EP)、邻苯二甲酸二正辛醋值0巧和邻苯二甲酸下基节醋 度BP)。最近研究指出PAEs具有环境激素的作用，它能干扰生物和人类的内分泌系统，引起 精子数量减少、精子形成中止、生殖能力下降、后代数量减少、子宫粘膜组织增生等。DEHP是 一种常见的PAEs,广泛用于食品包装材料、容器、医疗器械W及儿童玩具等领域，也是目前 世界上应用广泛和生产量大的人工合成的有机污染物之一。DEHP为无色透明油状液体，具 有较高的流动性、低水溶性W及低挥发性，其水解反应很慢。DEHP能够对机体造成生殖毒 性、发育毒性、神经毒性、多器官癌变等多种损伤。
[000引PAEs在环境中可通过非生物和生物两种途径进行降解，前者包括光解和水解，后 者主要是微生物降解，大多数情况下前者降解速率远低于后者，因此微生物降解是PAEs在 自然环境中的主要降解途径。目前，国内外的研究主要集中在从活性污泥中筛选高效降解 菌株对单一种类PAEs的生物降解。
[0004] 有关食碱戈登氏菌的报道相对较少，已知的戈登氏菌属在自然生态系统分布广 泛，如±壤、水、河口泥沙等，在人类活动系统中，包括产油水井、污水污泥W及临床病例中 都有存在。食碱戈登氏菌是从受污染±壤中首次分离得到的，根据其代谢底物的特点可被 应用到有机污染物的生物降解和被污染环境的生物修复。 阳〇化]近年来，研究人员对污染物的生物降解进行了广泛细致的研究，并取得了许多成 果。然而，微生物在工业废水中污染物的生物降解研究相对较少，主要是工业废水恶劣的条 件所制约，如高盐度、极端抑、溶氧量低等。因此，提供一种在高盐浓度、高抑、溫度范围广 泛条件下对多种邻苯二甲酸醋类物质具有降解能力的菌株对于治理环境污染具有重要的 经济价值和现实意义。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一株降解底物谱广的食碱戈登氏菌YC-化2及其应用。
[0007] 为了实现本发明目的，本发明从山东省荷泽市东明县油田附近±壤中分离到一株 能够降解多种邻苯二甲酸醋的细菌。该菌可将无机盐离子培养基中各lOOmg/L的邻苯二甲 酸二（2-乙基已基）醋值邸巧、邻苯二甲酸二环己醋值CHP)、邻苯二甲酸二甲醋值MP)、邻 苯二甲酸二正下醋值BP)、邻苯二甲酸二乙醋值EP)降解，对菌株进行连续转接测定降解能 力，表明该菌降解能力稳定。在电镜下观察（图1)，该菌为短杆状，无鞭毛，无芽抱。菌落呈 圆形，边缘光滑，表面突起，产生红色素（图2)。菌株革兰氏染色、过氧化氨酶活性及脈酶反 应均为阳性；氧化酶活性和吗I噪反应为阴性。基于形态特征及生理生化特征，将该菌株鉴定 为食碱戈登氏菌（Gardeniaa化anivorans)，命名为YC-I?L2。该菌株于2015年6月19日保 藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中屯、（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北 辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCCNo. 10992。
[0008] 本发明还提供含有所述食碱戈登氏菌YC-化2的菌剂。
[0009] 本发明还提供由所述食碱戈登氏菌YC-化2或所述菌剂制备的生物清洁剂。
[0010] 本发明还提供所述食碱戈登氏菌YC-化2、所述菌剂或所述生物清洁剂在有机污染 物生物降解中的应用。
[0011] 其中，所述有机污染物为邻苯二甲酸醋类物质。所述邻苯二甲酸醋类物质包括邻 苯二甲酸二（2-乙基已基）醋、邻苯二甲酸二环己醋、邻苯二甲酸二甲醋、邻苯二甲酸二乙 醋、邻苯二甲酸二下醋等。
[0012] 本发明还提供所述食碱戈登氏菌YC-化2、所述菌剂或所述生物清洁剂在有机污染 物生物降解中的应用。
[0013] 本发明还提供所述食碱戈登氏菌YC-化2、所述菌剂或所述生物清洁剂在邻苯二甲 酸醋类环境污染的生物修复中的应用。
[0014] 所述邻苯二甲酸醋类包括但不限于邻苯二甲酸二（2-乙基已基）醋、邻苯二甲酸 二环己醋、邻苯二甲酸二甲醋、邻苯二甲酸二乙醋、邻苯二甲酸二下醋。
[0015] 本发明进一步提供所述食碱戈登氏菌YC-化2在制备邻苯二甲酸醋类物质的生物 降解剂中的应用。
[0016] 本发明的食碱戈登氏菌YC-化2能够在5天内100 %降解无机盐培养基中含有的浓 度为lOOmg/L的DEHP，并能够降解DCHP、DMP、DEP和DBP。YC-化2对上述底物具有较高的 浓度耐受，在浓度为400-1000mg/L时，5天内降解率均在60%W上。
[0017] 另外，本发明的食碱戈登氏菌YC-化2对环境溫度具有较宽范围的耐受能力，在 10-40°C之间都能高效降解DCHP、DMP、DEP和DBP;对环境盐离子浓度也具有较高的耐受能 力，在化C1浓度为0-10 %时，可生长并降解上述底物，5天内对上述底物（各lOOmg/L)的 降解率均大于50%;同时，对碱性环境也具有较强的耐受能力，可耐受的抑范围为抑6-11， 5天内对上述底物（各lOOmg/L)的降解率均大于50%。
[0018] 本发明提供的食碱戈登氏菌YC-化2及其菌剂在使用过程中无污染，无公害，能够 应用于多种邻苯二甲酸醋类环境污染的生物修复及具有较高盐浓度、高抑生产废水的处 理，可在较低和较高溫度下进行生物修复，可广泛应用于环境±壤清洁领域及工业废水的 清洁处理，具有较好的经济价值和应用前景。
【附图说明】
[0019] 图1为本发明食碱戈登氏菌YC-化2在电镜下的形态结构图。
[0020] 图2为本发明食碱戈登氏菌YC-化2在LB固体培养基上的菌落形态。
[0021] 图3为本发明食碱戈登氏菌YC-化2的系统发育树。
[0022] 图4为本发明实施例2中HPLC法检测食碱戈登氏菌YC-化2对浓度分别为lOOmg/ L的DEHP、DCHP、DBP、DMP和DEP的降解能力。
[0023] 图5为本发明实施例2中DEHP、DCHP、DBP、DMP和DEP浓度与315nm处吸收峰面 积关系标准曲线图。
[0024] 图6为本发明实施例2中食碱戈登氏菌YC-化2对不同浓度底物的降解率。
[0025] 图7为本发明实施例2中食碱戈登氏菌YC-化2在不同溫度条件下对各底物的降 解率。
[0026] 图8为本发明实施例2中食碱戈登氏菌YC-化2在不同抑条件下对各底物的降解 率。
[0027] 图9为本发明实施例2中食碱戈登氏菌YC-化2在不同盐浓度条件下对各底物的 降解率。
【具体实施方式】
[0028]W下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例 中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0029]本申请使用的无机盐培养基组成如下：1.Og/LNH4NO3,0. 5g/L化C1，0. 5g/ L(NH4)2S04,0. 5g/LKH2PO4,1. 5g/LK2HPO4和0. 005g/L酵母提取物，pH=7. 0+0. 2。
[0030] 斜面培养基组成如下：10.Og/L蛋白腺，5. Og/L化Cl，10.Og/L酵母提取物，pH= 7.0+0.2。
[0031] 平板固体培养基为相应的培养基中加入1. 5%的琼脂。
[0032] 实施例1食碱戈登氏菌YC-化2的分离和鉴定
[0033] 1、菌株的分离
[0034] 从山东省荷泽市东明县受石油污染物的农田±壤中采集活性污泥样品。在无菌操 作条件下，将5g活性污泥样品接种到用50mL含lOOmg/LDEHP的无机盐离子培养基中，在 30°C，180巧m条件下培养。每培养7天后，取ImL转接至新鲜无机盐培养基中，连续转接3 次。
[0035] 将驯化后的菌液划线到含有lOOmg/LDEHP的无机盐培养基平板上，30°C培养箱中 培养3天。挑取在平板上的单菌落转接到含浓度为lOOmg/LDEHP的无机盐培中培养7天。 重复S次，直至分离获得纯化的菌株，将菌株命名为YC-化2。
[0036]2、菌株的形态学特征
[0037] 该菌为革兰氏染色为阳性短杆菌，菌体直或微弯、无鞭毛，无芽抱（图1);在LB培 养基上菌落为黄色，湿软，圆形凸起，边缘规整，不透明，表面光滑（图2)。
[0038] 3、菌株生理生化特性
[0039] 菌株革兰氏染色、过氧化氨酶活性及脈酶反应均为阳性；氧化酶活性和吗I噪反应 为阴性。
[0040] 4、16SrDNA鉴定
[0041]将菌株YC-化2接种到LB培养基中，30°C、18化pm条件下过夜培养，取1血菌液，离 屯、收集菌体，用细菌基因组提取试剂盒提取基因组DM,得到的基因DM用0. 8%琼脂糖凝 胶电泳进行检测，-20°C保存备用。
[0042] 设计用于扩增 16SrDNA序列的一对通用引物：27F5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' 和1492R5' -GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，用菌株YC-化2的基因组DM作为模板，加入Premix 化q?，进行PCR扩增，PCR产物用1 %琼脂糖凝胶电泳检测后，用DM纯化回收试剂盒纯化， 连接到pGM-T载体上，转化至大肠杆菌D册a感受态细胞中，涂布到含有氨节青霉素的LB 固体培养基平板上，在37°C下培养12h，挑取白色菌落至液体LB培养基中，37°C、ISOrpm 振荡培养过夜，用质粒提取试剂盒提取质粒，送上海生工生物公司进行测序。将测序结果 (GenBank:KR819396)在NCBI网站化ttp://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上进行Blast比对 分析，并利用MEGA软件（版本：6. 0)构建系统发育树（图3)。
[0043] 综合菌体形态、生理生化特性、16SrDNA基因序列，菌株YC-化2被鉴定为食碱戈 登氏菌（Gardeniaalkanivorans)。 W44] 实施例2食碱戈登氏菌YC-化2的降解性能试验 W45] 1、食碱戈登氏菌YC-化2对邻苯二甲酸二（2-乙基已基）醋触HP)、邻苯二甲酸二 环己醋值CHP)、邻苯二甲酸二甲醋值MP)、邻