一种非变性植物全蛋白提取液及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及到植物蛋白提取，属于植物生理生化技术领域，具体是一种非变性植 物全蛋白提取液及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 植物生理生化的研究离不开相关酶活性的检测，如在不同胁迫条件下所经常关注 的S0D酶活性、GST酶活性的变化等。由于不同酶活性的专一性，使用全蛋白提取物进行检 测不需要对目的蛋白进行纯化，具有省时省力、结果可靠的特点。目前市场上的植物蛋白提 取液非常多，一般都是应用于后续蛋白质组学研究的，其特点在于加入尿素、DTT等。尿素 使蛋白变性，无法进行酶活性分析；而DTT等还原剂对BCA、Bradford等测定蛋白浓度方法 的干扰严重，无法对酶活性进行准确定量比较。很多实验室在提取植物全蛋白进行生理生 化分析时，为了避免蛋白变性降解等，需要在提取后马上进行分析，对于大批量样本来讲显 然是不现实的。因此本发明公开的植物全蛋白提取液摈弃了尿素、DTT等，添加了可以保护 并延缓蛋白降解的甘油，提取后的样品可以马上检测也可以冷冻保存数月（超低温保存可 以更久）后再进行检测，既可以进行酶活分析也可以进行蛋白定量，极大的方便了植物生理 生化相关研究。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的正是基于上述现有技术状况而提供一种非变性植物全蛋白提取液 的配方及其制备方法，供植物生理生化研究人员使用和借鉴。
[0004] 本发明的目的是通过以下技术方案来实现的： 一种非变性植物全蛋白提取液，是包含有以下成分的水溶液： 1) 50-200mM磷酸缓冲液 2) O-lOmMEDTA 3) 5%_10% (w/v，单位g/ml)甘油 4) 0. 2%-0. 5% (w/v，单位g/ml)聚乙烯吡咯烷酮PVP 5) 蛋白酶抑制剂，添加量按照提取液体积的1/100-1/200加入。
[0005] 所述磷酸缓冲液的pH值在7. 0-8. 0之间，由磷酸一氢钠和磷酸二氢钠配制而成。
[0006] 所述EDTA为事先配好的pH为L0-8. 0的200mMEDTA-Na母液或者是200mMEDTA 母液。
[0007] 所述提取液使用前需要预冷至0-4°C。
[0008] 本发明的提取液特点有以下几点： 1、不限制NaCl等盐的加入。
[0009] 2、使用了甘油作为蛋白保护剂，且甘油浓度在5%-10%之间。
[0010] 3、不使用巯基乙醇、二硫苏糖醇等还原剂。
[0011] 4、不使用尿素等蛋白变性试剂。
[0012] 5、使用前需要预冷。
[0013] 6、加入PVP和蛋白酶抑制剂前可以长期存放。
[0014] 7、加入蛋白酶抑制剂后最好于当天使用。
[0015] 制备本发明非变性植物全蛋白提取液的方法，分以下三个步骤制备： 第一步：先将磷酸缓冲液、EDTA、甘油按照所需浓度混匀，定容至所需容量； 第二步：将所配溶液高压灭菌； 第三步：使用前加入PVP和蛋白酶抑制剂。
[0016] 其具体步骤如下： 1. 按照不同pH值磷酸缓冲液的配比表，分别称取所需的NaH2POJPNa2ΗΡ04; 2. 按照质量体积百分比称取甘油； 3. 根据最终浓度要求加入200mM的EDTA-Na母液（pH7. 0-8. 0); 4. 将前面3步的试剂放在一个烧杯中，加入去离子水至所需刻度之下，放入磁力搅拌 子，搅拌混匀； 5. 将烧杯内的溶液用容量瓶或量筒定容至所需体积； 6. 转移至试剂瓶，试剂瓶盖不拧紧，121°C高压灭菌15分钟； 7. 待温度冷却至室温后，拧紧试剂瓶盖，常温或4°C冷藏保存； 8. 使用前，取出适量体积，按照质量百分比加入聚乙烯吡咯烷酮（PVP)，振荡混匀； 9. 加入适量蛋白酶抑制剂，混匀后冰浴放置待用，如果加PVP前的溶液是常温存放需 要在加蛋白酶抑制剂前冰浴30分钟。
[0017] 使用上述提取液提取植物总蛋白，从A280nm的光吸收和GST蛋白酶活性来看，其 提取量与市售的一些提取液的提取能力相当（见表1和表2);本发明所提供的蛋白提取液 配置简单，所需试剂均为实验室常用试剂，价格便宜；而试剂配好后方便长期存放易于运 输，具有一定的市场价值，因此有必要通过专利加以保护。
[0018] 本发明的突出优点在于：使用该蛋白提取液提取的植物全蛋白适用于蛋白酶活性 的分析及BCA等方法对蛋白浓度的测定。其特点在于不对蛋白进行变性，不添加影响BCA 等测定的还原剂，提取后的蛋白可冷冻保存数月，复融后基本无沉淀，且保存前后蛋白活性 基本不受影响，提取的蛋白量较高，还可直接用于进一步分离纯化，因此该提取液在植物生 理生化研究方面具有重要的应用价值。
【具体实施方式】
[0019] 本发明以下通过一个具体实施例做进一步详细说明： 1.配置提取液 配置1L提取液：含有100mM磷酸缓冲液、5mMEDTA、5%甘油、2. 5%PVP和蛋白酶抑制剂： 称取29. 367克Na2HP04· 12H20和2. 808克NaH2P04· 2H20加入1L烧杯内，溶解后作为 pH7. 5、lOOmM的磷酸缓冲液； 加入配置好的PH7. 5的200mM的EDTA-Na母液25ml; 将烧杯直接放在百分之一天平上，称取50克甘油； 加入搅拌子，用磁力搅拌器搅拌均匀； 用量筒加入去离子水定容至1L; 倒入1L试剂瓶中，将瓶盖松松的拧上，用灭菌指示条将瓶盖与瓶身固定，高温灭菌； 冷却至室温后，拧紧瓶盖，4°C保存备用； 使用前，取出50ml，加入1. 25克PVP粉末，漩涡震荡溶解； 加入蛋白酶抑制剂(上海生工，BS380) 250μ1，上下颠倒混匀，放于冰上待用。
[0020] 2.提取全蛋白 以烟草为例，分别称取新鲜烟草叶和根各1克放入两个5ml离心管中，按照1:3 (W/V) 的比例分别加入提取液3ml; 用手持式匀浆机在冰浴下匀浆30s; 14000Xg，4°C，离心 20min; 用枪头将上清转移至新的离心管中，叶片的提取液标记为L，根的提取液标记为R。
[0021] 同时用一商品化的植物蛋白提取液(不含尿素，含有DTT)进行同样的提取操作，但 只提取烟草叶片的总蛋白，所提取蛋白标记为S。
[0022] 3.活性测定 将提取到的烟草全蛋白取出一部分进行活性测定；其余分成两份，一份用液氮快速 冷冻后放于超低温冰箱中，一份冻存于-20°C，于2个月后全部取出复融；样品复融后， 14000Xg，4°C，离心10分钟后再进行活性测定； 测定全蛋白提取液的谷胱甘肽转移酶活性，使用的底物是GSH和CDNB; 活性测定结果如表1所示。
[0023] 4.提取的总蛋白的蛋白含量测定 使用BCA的方法及A280的光吸收值确定总蛋白含量，商品化的提取液中由于含有DTT， 对BCA测定结果干扰很大，无法得出提取蛋白的浓度。
[0024] 本发明所公开的提取液所提取的蛋白浓度及全部样品的A280值见表2。
[0025] 从表1和表2可以看出与市售的提取液相比，本发明所公开的提取液的提取效率 及提取蛋白的活性与其相当；随着冷冻保存，本发明提取液的蛋白活性变化不大，而用市售 提取液所提取蛋白的活性则明显降低。
[0026]
【主权项】
1. 一种非变性植物全蛋白提取液，其特征在于：该提取液是包含有以下成分的水溶 液： 1) 50-200mM磷酸缓冲液， 2. I-IOmM EDTA, 3) 5%-10% 甘油， 4) 0. 2%-0. 5%聚乙烯吡咯烷酮PVP， 5) 蛋白酶抑制剂。2. 根据权利要求1所述的非变性植物全蛋白提取液，其特征在于：所述磷酸缓冲液的 pH值在7. 0-8. 0之间，由磷酸一氢钠和磷酸二氢钠配制而成。3. 根据权利要求1所述的非变性植物全蛋白提取液，其特征在于：所述EDTA为事先配 好的 pH 为 7. 0-8. 0 的 200mM EDTA 母液。4. 根据权利要求1所述的非变性植物全蛋白提取液，其特征在于：所述提取液使用前 需要预冷至0-4°C。5. 根据权利要求1所述的非变性植物全蛋白提取液，其特征在于：蛋白酶抑制剂的添 加量按照提取液体积的1/100-1/200加入。6. -种如权利要求1所述的非变性植物全蛋白提取液的制备方法，其特征在于：分三 步制备： 1) 先将磷酸缓冲液、EDTA、甘油按照所需浓度混匀，定容至所需容量； 2) 将所配溶液高压灭菌； 3) 使用前加入PVP和蛋白酶抑制剂。
【专利摘要】本发明涉及植物蛋白提取，具体是一种非变性植物全蛋白提取液及其制备方法，其特征在于：该提取液是包含有以下成分的水溶液：磷酸缓冲液、EDTA、甘油、聚乙烯吡咯烷酮PVP及蛋白酶抑制剂。本发明的特点在于使用该蛋白提取液提取的植物全蛋白适用于蛋白酶活性的分析及BCA等方法对蛋白浓度的测定。该提取液的特点在于不对蛋白进行变性，不添加影响BCA等测定的还原剂，提取后的蛋白可冷冻保存数月，复融后基本无沉淀，且保存前后蛋白活性基本不受影响，提取的蛋白量较高，还可直接用于进一步分离纯化，因此该提取液在植物生理生化研究方面具有重要的应用价值。
【IPC分类】C07K1/14
【公开号】CN105237613
【申请号】CN201510773280
【发明人】周会娜, 刘萍萍, 翟妞, 陈霞, 陈千思, 毛李鸿, 郑庆霞, 徐国云, 张慧, 林福呈
【申请人】中国烟草总公司郑州烟草研究院
【公开日】2016年1月13日
【申请日】2015年11月13日