一种高纯度放线菌素d的提纯方法
【技术领域】
[0001] 本发明具体设及一种高纯度放线菌素D的提纯方法。
【背景技术】 阳〇〇引放线菌素D(ActinomycinD，AMD，别名更生霉素）最早就是从放线菌S. melanoc虹omogenes No.1779或者S. Parvullus中分离得到的，属于放线菌素家族的一 员，运类化合物由多种链霉菌属的微生物产生。该类化合物结构中往往都含有一个能使之 显红色或者黄色的杂^环发色团4(：^11〇^11:2_氨基_4,6_二甲基吩嗯嗦_(3)_氧_ 1，9一二簇酸，差别在于其上连接的环状五肤结构因放线菌素的种类不同而不同。
[0003] AMD己广泛用于恶性肿瘤的临床治疗，是较为理想的抗肿瘤药物，也是国家基本医 疗保险药物品种之一。结合手术治疗和放射治疗，AMD对肾母细胞瘤、横纹肌肉瘤、神经母 细胞瘤、霍奇金病及绒毛膜癌的治疗有效，对睾丸肿瘤也有一定疗效，尤其是对儿童肾母细 胞瘤（Wilm'Stumor)有很好的治疗效果，总体治疗率可W达到70~80%，对于没有明显 肿瘤转移的病患治愈率可W上升到80~90%。此外，还常与其他药物联合用于肿瘤的治疗 与研究。放线菌素D与氨甲噪岭联合用药治疗妊娠期绒膜癌，治愈率可达到70~90%，并 对已转移的肿瘤也有很好的抑制效果。放线菌素D与氨甲噪岭、长春新碱W及苯基下酸氮 芥联合用药可W有效治疗睾丸肿瘤，放线菌素D与博来霉素等药物联合治疗卵巢癌可使五 年生存率达到87. 5%。
[0004] 目前AMD研究主要集中在其作用机理和化学结构的改造。作用机理研究主要为 AMD与核酸的作用，认为其发挥抗菌、抗肿瘤、抗病毒的主要机理是干扰核酸的合成。此外， 研究发现AMD还能通过诱导细胞分化、诱导细胞调亡，抑制一些蛋白酶活性及影响细胞周 期等而发挥其抗肿瘤活性。对AMD的化学改造可W分为两类，一类是在吩嗯嗦酬环上的改 造，另一类则是环五肤的结构改造。研究发现AMD的抗瘤谱比较有限，并且具有较大毒性从 而严重影响了其使用剂量和使用范围。因此，为了满足临床的需要，迫切需要生产高纯度的 AMD。 阳005] AMD的分离提纯方法描述见于CN200610019395、CN201110366034等。CN200610019395记载的更新霉素（即放线菌素D和放线菌素S3混合物）通过结晶进一 步提纯方法；CN201110366034描述方法HPLC方法只能生产实验室用低数量的AMD,W及纯 AMD的回收率低。其它主要采用正相层析如硅胶或氧化侣柱层析法同样存在分离周期长、回 收率低、分离效果差等问题。因此，在技术上需要有生产AMD W及分离和纯化AMD的改进方 法。
【发明内容】
[0006]本发明要解决的技术问题，在于提供一种高纯度放线菌素D的提纯方法。
[0007]本发明是运样实现的：一种高纯度放线菌素D的提纯方法，其操作方法如下：W链 霉菌发酵产生的放线菌素D粗提物为原料，将粗提物用强极性溶剂配成样品溶液，上反相 柱吸附，层析柱预先用20% (V/V)强极性溶剂的水溶液3倍柱体积平衡，用强极性溶剂的水 溶液作解析液进行梯度洗脱或恒定浓度洗脱；所述反相柱填料为纳米微球材料。
[0008] 优选地，所述纳米微球材料为W聚苯乙締/二乙締基苯聚合物为基质的 PS40-300 ;或W聚二乙締基苯/丙締酸醋聚合物为基质的PSM0-300。
[0009] 优选地，所述反相柱填料的粒径为40um，孔径为300A。
[0010] 优选地，所述反相柱填料的用量为放线菌素D粗提物重量的80-120倍体积。
[0011] 优选地，所述强极性溶剂为甲醇、乙醇。
[0012] 优选地，所述解析液的浓度为40%-80%(V/V)。
[0013] 优选地，所述梯度洗脱的梯度为体积比40:60,60:40,80:20的强极性溶剂-水的 溶剂系统
[0014] 优选地，所述恒定浓度为65% (V/V)。
[0015] 本发明的优点在于：对AMD粗提物的分离度高，获得的目标产物纯度高，分离纯化 过程条件溫和、分离过程高效便捷、分离制备量大，适合自动化生产，具有很高的经济效益。
【附图说明】
[0016] 下面参照附图结合实施例对本发明作进一步的说明。
[0017] 图1是本发明中链霉菌发酵产生的AMD粗提物的HPLC图谱。
[0018] 图2是本发明中实施例1制得的AMD的中压制备图谱。
[0019] 图3是本发明中实施例1制得的高纯度AMD的HPLC图谱。
【具体实施方式】
[0020] 一种高纯度放线菌素D的提纯方法，其操作方法如下：W链霉菌发酵产生的放线 菌素D粗提物为原料，将粗提物用强极性溶剂配成样品溶液，上反相柱吸附，层析柱预先用 20% (V/V)强极性溶剂的水溶液3倍柱体积平衡，用强极性溶剂的水溶液作解析液进行梯 度洗脱或恒定浓度洗脱。所述强极性溶剂为甲醇、乙醇；所述解析液的浓度为40% -80% (V/V);所述梯度洗脱的梯度为体积比强极性溶剂：水=40:60,60:40,80:20的强极性溶 剂-水的溶剂系统；所述恒定浓度为65% (V/V)(体积分数）。
[0021] 所述反相柱填料为纳米微球材料；所述纳米微球材料为W聚苯乙締/二乙締基苯 聚合物为基质的PS40-300 ;或W聚二乙締基苯/丙締酸醋聚合物为基质的PSM0-300。所 述反相柱填料的用量为放线菌素D粗提物重量的80-120倍体积；所述纳米微球材料的粒径 为40um，孔径为300A。严格控制填料粒径大小和孔径结构，高度的粒径均一性使填料具有 高分辨率、高载量、高回收率、低反压，集中洗脱等特点。高的机械强度保证了高耐压性能， 全抑范围（pH1-14)耐受性，提供了更多的选择可能性，更高的化学稳定性，具有更彻底的 清洗能力，同时克服了硅胶色谱填料的抑适用范围窄、使用寿命短等缺点。 阳0巧放线菌素D粗提物的获取：链霉菌发酵结束后，发酵液通过大孔吸附树脂吸附，乙 醇洗脱，收集乙醇浓缩至无醇味后，加入乙酸下醋与水（1 :1)配制的溶液，萃取3次，收集乙 酸下醋相，浓缩得到粗提物。
[0023] W下结合实施例对本发明作进一步地说明。 W24] 实施例一
[00巧]将放线菌素D粗提物50g，用乙醇200ml充分溶解，过滤，得样品溶液。层析柱装有 纳米微粒PS40-300(粒径40um，孔径300A)5L层析柱预先用20%乙醇的水溶液3倍柱体 积平衡，样品溶液上反相柱吸附，然后用65%甲醇的水溶液洗脱，用HPLC方法测定收集液， 合并纯度大于95 %的AMD收集液，收率70. 2 %。 W26] 实施例二
[0027]将放线菌素D粗提物50g，用乙醇200ml充分溶解，过滤，得样品溶液。层析柱装 有纳米微粒PSM0-300(粒径40um，孔径3斯)Λ)5L层析柱预先用20%乙醇的水溶液3倍 柱体积平衡，样品溶液上反相柱吸附，然后用40%乙醇的水溶液3倍柱体积解析，最后用体 积比40:60,60:40,80:20的乙醇一水溶液梯度洗脱，HPLC方法测定收集液，合并纯度大于 95 %的AMD收集液，收率57. 5 %。 阳0測 实施例S
[0029] 将放线菌素D粗提物lOOg，用乙醇500ml充分溶解，过滤，得样品溶液。层析柱装 有纳米微粒PS40-300 (粒径40um，孔径300A) 10L层析柱预先用20%乙醇的水溶液3倍 柱体积平衡，样品溶液上反相柱吸附，然后用65%乙醇的水溶液解析，用HPLC方法测定收 集液，合并纯度大于95%的AMD收集液，收率61. 4%。
[0030] 请参阅图1-3所示，上述实施例洗脱获得的洗脱物采用HPLC和中压液相色谱仪检 巧。，HPLC检测条件为：C18色谱柱；体积比7:3的甲醇/水为流动化检测波长254nm;中压 液相色谱仪：EZPurifyIII，上海利穗有限公司。
[0031] 本发明的反相填料严格控制粒径大小和孔径结构，高度的粒径均一性使其具有高 分辨率，高载量，高回收率，低反压，集中洗脱等特点，高的机械强度保证了高耐压性能，全 抑范围（pH1-14)耐受性，提供了更多的选择可能性，更高的化学稳定性，具有更彻底的清 洗能力，同时克服了硅胶色谱填料抑适用范围窄、使用寿命短等缺点。本发明分离纯化过 程条件溫和、分离过程高效便捷、分离制备量大、分离度高，且提纯后获得的目标产物纯度 高，同时本发明适合自动化生产，具有很高的经济效益。
【主权项】
1. 一种高纯度放线菌素D的提纯方法，其特征在于：其操作方法如下：以链霉菌发酵产 生的放线菌素D粗提物为原料，将粗提物用强极性溶剂配成样品溶液，上反相柱吸附，层析 柱预先用20% (V/V)强极性溶剂的水溶液3倍柱体积平衡，用强极性溶剂的水溶液作解析 液进行梯度洗脱或恒定浓度洗脱；所述反相柱填料为纳米微球材料。2. 如权利要求1所述的一种高纯度放线菌素D的提纯方法，其特征在于：所述纳米微 球材料为以聚苯乙烯/二乙烯基苯聚合物为基质的PS40-300 ;或以聚二乙烯基苯/丙烯酸 酯聚合物为基质的PSN40-300。3. 如权利要求2所述的一种高纯度放线菌素D的提纯方法，其特征在于：所述反相柱 填料的粒径为40um，孔径为300A。4.如权利要求1所述的一种高纯度放线菌素D的提纯方法，其特征在于：所述反相柱 填料的用量为放线菌素D粗提物重量的80-120倍体积。5. 如权利要求1所述的一种高纯度放线菌素D的提纯方法，其特征在于：所述强极性 溶剂为甲醇、乙醇。6. 如权利要求1所述的一种高纯度放线菌素D的提纯方法，其特征在于：所述解析液 的浓度为 40% -80% (V/V)。7.如权利要求1所述的一种高纯度放线菌素D的提纯方法，其特征在于：所述梯度洗 脱的梯度为体积比40:60,60:40,80:20的强极性溶剂-水的溶剂系统。8. 如权利要求1所述的一种高纯度放线菌素D的提纯方法，其特征在于：所述恒定浓 度为 65% (V/V)。
【专利摘要】本发明提供了一种高纯度放线菌素D的提纯方法，其操作方法如下：以链霉菌发酵产生的放线菌素D粗提物为原料，将粗提物用强极性溶剂配成样品溶液，上反相柱吸附，层析柱预先用20％强极性溶剂的水溶液3倍柱体积平衡，用强极性溶剂的水溶液作解析液进行梯度洗脱或恒定浓度洗脱。
【IPC分类】C07K1/20, C07K7/06
【公开号】CN105254712
【申请号】CN201510611348
【发明人】杨煌建, 张祝兰, 王德森, 任林英, 唐文力
【申请人】福建省微生物研究所
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2015年9月23日