W更窄的抑间隔重复先前的实验，W精炼最佳抑的估计值。对含有相同抗体的 不同细胞培养收获物进行运些实验。完整结果描述于下表中。
[0154]
[0155] 实施例32.在不存在官能化颗粒添加的情况下抑和电导率的组合影响。进行一 系列实验，评估抑4. 8、抑5. 2和抑5. 6的作用，各在12mS/cm、16mS/cm和20mS/cm的电 导率值下进行。起始材料为含有相同抗体加213, 821ppm宿主蛋白质和25. 6%聚集物的细 胞培养收获物。数据显示，所公开的方法，即使限于尿囊素和辛酸组分，也实现了比单独辛 酸（实施例30)显著更好的结果。完整结果描述于下表中。
[0156]
[0157] 实施例33.市售TREN颗粒与实验制备的TREN颗粒的比较。市售TREN颗粒被制 造为进行固定化金属亲和色谱技术并且体现非实施所公开方法所必要的物理性质，例如所 述颗粒中的耐压力、限定的均质粒径分布和限定的孔径分布。除了不必要之外，运些特征还 使得所述颗粒价格昂贵。我们从廉价的生物可降解的纤维素颗粒和纤维素纤维制备TREN 颗粒。用1M化細、ImM棚氨化钢、lOOmMS(2-氨乙基）胺灯REN)和320mM表氯醇平衡所 述颗粒或纤维，然后在50°C反应化。用1M化C1替代所述缓冲液，然后用水替代，W洗掉 残余的反应物和反应副产物。通过阴离子型染料甲基蓝的结合来确认TREN的固定化。在 用1%尿囊素和0.4%辛酸（pH5.2)处理所述收获物之后，将实验颗粒与市售TREN颗粒于 5%v:v进行比较。含IgG的细胞培养物含有28. 3%聚集物和258,999ppm宿主蛋白质。完 整结果呈现于下表中。cTREN是指市售TREN度ioWorksTRENhi曲)CP是指纤维素颗粒。CF 是指纤维素纤维。1 %实验颗粒的性能优于1 %市售TREN，但5%市售TREN的性能优于5% 实验颗粒。
[015 引
[0159] 实施例34.所公开的方法与添加活性碳颗粒的比较。将所述方法应用于含有 282, 77化pm宿主蛋白质和33. 4%聚集物的含IgG的细胞培养收获物。用0. 4%丙締酸和 1%尿囊素加〇%、1%、2%或4%活性碳（4-12目，Darco)处理所述收获物。活性碳的添加 降低宿主蛋白质，但不成比例地降低抗体回收率。活性碳在4%时还严重地且无预告地消除 来自样品的所有蛋白质，包括IgG。结果呈现于下表中。
[0160]
[0161] 实施例35.用不同的带正电荷的物质官能化的颗粒的影响。比较1% (v:v)、 2%、3%、4%、和5%的市售TREN的效果与相同水平的DowexAGlX2的效果。利用还含有 188, 503ppm宿主蛋白质和26. 4%聚集物的含IgG的收获物进行所述实验。简单地说，Dowex 支持略佳的回收率和聚集物去除，但通过TREN更有效地去除宿主蛋白质和游离轻链。结果 呈现于下表中。
[0162]
[016引实施例36.用不同的表面化学性来官能化的颗粒的影响。W还含有241，241ppm宿主蛋白质和23. 3%聚集物的含IgG的细胞培养收获物评估W下物质的效果：1)二簇基阳 离子交换剂（Qielex-lOO, Bio-Rad)、2)横基阳离子交换剂（MacroPrep Hi曲S, Bio-Rad)、 带负电荷的烷基疏水固相（MacroPrep忧utyl,Bi0-Rad)、在甲基丙締酸醋聚合物骨架上具 有更小浓度的带负电荷基团的带正电荷颗粒（MacroPrep化曲曲W及TREN度ioWorks TREN hi曲）与Dowex AGlx2的组合。将尿囊素添加至1%的浓度，然后添加0. 4%的辛酸。将抑 滴定到5. 2并且将样品混合2小时直到所述颗粒的添加持续额外4小时。数据呈现于下表 中。P物质是指各种固相化学性。
[0164]
[0165] 实施例37.固体和溶解的巧化合物对所公开的方法的影响。用1 %尿囊素、0.4% 辛酸、各种浓度的氯化巧或径憐灰石处理还含有652, 45化pm和34. 1 %聚集物的含IgG的细 胞培养收获物，滴定到抑5. 2并且混合2小时。去除固体并且评估样品。0.5mM到8.0ml 范围的巧浓度对IgG回收率没有显著作用。HCP在~70, 000-80, 0(K)ppm的范围，轻链含量 几乎没有降低，并且聚集物水平通常降低到~2. 5%。0. 5%到4%的v:v浓度的径憐灰石 将IgG回收率从0. 5%HA下的79%降低到8%HA下的38%。宿主蛋白质降低，但降低小 于IgG的损失。轻链含量未有效地降低。聚集物降低到所述研究中的最低值，但不足W补 偿抗体损失。数据呈现于下表中。CA物质分别是指氯化巧（CC)或径基憐灰石（HA)。标记 为"基础"的行指示在没有任何巧添加剂的情况下获得的结果。
[0166]
[0167]实施例38.纯化和IgM单克隆抗体。通过添加1 %尿囊素、0.4%辛酸（产生约 5. 6的操作pH)来处理无细胞的细胞培养收获物。在室溫下将混合物解育2小时，然后添加 5%v/v的量的TREN颗粒度io-WorksTRENhi曲），并且在室溫下混合解育4小时，此后通 过离屯、和微滤去除固体。分析型尺寸排阻色谱显示聚集物从约23%的原始浓度降低到小 于0.5%。没有观察到宿主蛋白质峰，表明大于98%的纯度，不包括低分子量的细胞培养基 组分。在其中使处理过的IgM经过与实施例14中的IgG相同的深度过滤器的平行实验中， IgM损失，表明其与深度过滤器的内部表面结合。
[016引实施例39.非离子型表面活性剂的作用。将1%尿囊素添加到通过离屯、和微滤澄 清的细胞培养收获物的4个50mL等分试样中的每一个中。一个等分试样保留作为对照。将 吐溫灯ween)-20分别W0. 005%、0. 01%和0. 02%的量添加到另外Ξ个等分试样中。将样 品解育10分钟，之后添加辛酸到0. 4%，并且通过添加1M乙酸调节到抑5. 3,然后解育2 小时。将样品取出并且过滤用于分析。将TREN颗粒W5%的量添加到样品剩余物中，混合 4小时，然后通过微滤去除固体。直到添加TREN颗粒时，聚集物含量从对照到0. 005%吐溫 而降低，然后在0.01%吐溫再次降低，但使用0.02%吐溫未进一步改善。抗体回收率和过 量游离轻链的含量大致无变化。在添加TREN颗粒之后，所有样品内的聚集物水平均相同， 并且轻链含量几乎不受影响，但在高达0.01 %的吐溫含量下，IgG回收率增加，但在0.02% 下无进一步增加。
[0169]
[0170] 实施例40.非离子型表面活性剂、两性离子型表面活性剂和阳离子型表面活性剂 的作用。将1 %尿囊素添加到通过离屯、和微滤澄清的细胞培养收获物的每一 50mL等分试样 中。一个等分试样保留作为对照。将W下表面活性剂分别W0.01%和0.05%添加到两个 等分试样中的每一个中：乙醇酸乙氧酸4-壬基苯酸（Glych.，非离子型）、乙二胺丙氧基化 物-嵌段-乙氧基化物四醇Ο?Τ，非离子型）、化ij58(PluronicF-127,非离子型）、化iton X-100(非离子型）、NonidetP40(非离子型）、3-[(3-胆酷胺丙基）二甲基氨基]-1-丙横 酸盐水合物（CHAPS,两性离子型）、十六烷基Ξ甲基漠化锭（CTAB，阳离子型）、十二烷基Ξ 甲基漠化锭值DTAB，阳离子型）、癸基Ξ甲基漠化锭值TAB)阳离子型）、肉豆寇基Ξ甲基漠 化锭（MTAB，阳离子型）、十八烷基Ξ甲基漠化锭（0TAB，阳离子型）。将样品解育10分钟， 之后添加辛酸到0. 4%，并且通过添加1M乙酸调节到pH5. 3,然后解育2小时。
[0171]
[0173]实施例41.不同脂肪酸的作用。将1%尿囊素添加到通过离屯、和微滤澄清的细胞 培养收获物的每一 50mL等分试样中。一个等分试样保留作为对照。添加至0.4%的辛酸 作为另一对照，并且通过添加1M乙酸将抑调节到5. 3,然后混合解育2小时。用0. 1 %、 0. 2%、0. 3%、0. 4%和0.5% 2-乙基己酸巧HA)处理收获物的5个等分试样。利用3-庚締 酸（3HA)、然后利用3-辛締酸（30A)和8-壬締酸（8NA)重复运些实验。
[0174]
[0176]实施例42.在利用官能化颗粒和不利用官能化颗粒的情况下对辛酸与8-庚締酸 的比较。将1 %尿囊素添加到通过离屯、和微滤澄清的细胞培养收获物的每一 50mL等分试样 中。一个等分试样保留作为对照。添加至0.4%的辛酸作为另一对照，并且通过添加1M乙 酸将抑调节到5. 3。将所述混合物混合解育2小时并且取出样品用于测试，然后添加5% (V:v)的量的TREN颗粒，并且混合解育额外4小时。通过微滤去除固体，然后分析。利用 0. 4%、0. 5%和0. 6%的8-庚締酸重复该实验形式。
[0177]
[0179] 如通过实施例所说明的，所公开的方法可与其它纯化方法组合W实现更高的纯化 水平。此类其它纯化方法的示例包括但不限于常用于纯化IgG的其它方法，例如蛋白A和 其它形式的亲和色谱、阴离子交换色谱、阳离子交换色谱、疏水相互作用色谱和混合模式的 色谱方法；W及沉淀方法，包括利用例如聚乙二醇的非离子型聚合物的抗体沉淀或利用例 如硫酸锭、硫酸钢、硫酸钟、巧樣酸钢或巧樣酸钟的盐的抗体沉淀；W及结晶和两相水性萃 取的方法。研发用于各种方法的适当条件并且将它们与本文所公开的方法整合W实现特定 抗体的必要纯化，在本领域技术人员的能力范围内。
[0180] 本文所引用的所有参考文献均W引用方式且出于所有目的整体并入，其并入程度 就如同每个单独的出版物或专利或专利申请被具体地且个别地指明出于所有目的W引用 方式整体并入一样。当W引用方式并入的出版物和专利或专利申请与本说明书中所含的公 开内容相冲突时，本说明书意在替代和/或优先于任何此类相冲突的材料。
[0181] 用于本说明书和权利要求中的所有表示成分的量、色谱条件等的数字均应当理解 为在所有情况下被术语"约"修饰。因此，除非另有相反指明，否则本说明书和所附权利要 求书中陈述的数字参数为近似值，其可根据本发明试图获得的期望性能而改变。
[0182] 如对本领域技术人员将显而易见的，可进行本发明的许多更改和变化，而不脱离 其它们的精神和范围。本文所述的具体实施方案仅W举例方式提供，而不意在W任何方式 进行限制。本说明书和实施例意在被认为仅仅是示例性的，本发明的真正范围和精神由所 附权利要求书指明。
【主权项】
1. 一种纯化抗体的方法，其包括： (a) 使包含至少一种抗体的细胞培养收获物或蛋白质制剂与具有7到10个碳原子的至 少一种脂肪酸接触以形成混合物； (b) 使所述混合物与选自由固体基底、可溶性基底和其组合组成的组的一种或多种官 能化基底接触，其中所述一种或多种官能化基底包含阳离子型官能团、金属结合官能团或 两者； 其中所述金属结合官能团包含选自由以下组成的组的含氮部分：（1)聚胺、（2)亚胺、 (3)N-杂环、（4)氨基酸、（5)N-羟基酰胺、（6)芳基胺和其组合；和 (c) 在使所述混合物与所述一种或多种官能化基底接触之后分离固体材料，以提供包 含所述抗体的溶液。2. 根据权利要求1所述的方法，其进一步包括（d)使所述细胞培养收获物与尿囊素接 触。3. 根据权利要求2所述的方法，其中尿囊素以选自由以下组成的组的范围的浓度存 在：（a)约0.6%到约30%、（b)约1 %到约10%和（c)约1 %到约2%。4. 根据权利要求2所述的方法，其中尿囊素在非零量到高达约0. 6%的范围。5. 根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种官能化基底的总量是所述制剂的 总体积的约 〇· 〇1%、〇· 05%、0· 1%、0· 25%、0· 5%、1%、2%、5%、10%、20%或其间的中间 值的体积比例。6. 根据权利要求1所述的方法，其中所述至少一种脂肪酸和所述一种或多种官能化基 底被安置在单个容器中。7. 根据权利要求1所述的方法，其中所述一种或多种官能化基底被安置在允许流体经 过而阻止固体材料从中经过的装置中。8. 根据权利要求7所述的方法，其中所述装置包含选自由以下组成的组的多孔材料： 膜、整体柱、织造材料、晶体材料、凝胶状材料、填充颗粒柱和其组合。9. 根据权利要求1所述的方法，其中步骤（b)是利用安置在装置中的所述一种或多种 官能化基底实施的。10. 根据权利要求1所述的方法，其中通过沉降或离心之后沉降来去除所述固体材料。11. 根据权利要求1所述的方法，其中通过过滤来去除所述固体材料。12. 根据权利要求11所述的方法，其中过滤包括膜过滤或深度过滤。13. 根据权利要求12所述的方法，其中所述膜过滤或深度过滤包含官能化的接触表 面。14. 根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述步骤（a)之前是所述抗体的部 分纯化。15. 根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述细胞培养收获物或蛋白质制剂 含有细胞，并且任选地驻留于产生所述细胞培养收获物的生物反应器中。16. 根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述细胞培养收获物或蛋白质制剂 不含细胞。17. 根据权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述蛋白质制剂为天然存在的生物 流体。18. 根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其中所述至少一种脂肪酸包含CH3(CH2) nCOOH的一般结构式，其中η为5到8的整数。19. 根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述至少一种脂肪酸包括庚酸、辛 酸、辛烯酸、壬酸、壬烯酸或癸酸。20. 根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述至少一种脂肪酸为壬酸。21. 根据权利要求1-20中任一项所述的方法，其中所述至少一种脂肪酸以选自由以下 组成的组的范围的浓度存在：（a)约0. 05%到约5%、（b)约0. 1%到约1. 0%、（c)约0. 2% 到约 0. 4%和（d)约 0. 1 %到 0. 2%。22. 根据权利要求1-21中任一项所述的方法，其中所述混合物包含表面活性剂。23. 根据权利要求22所述的方法，其中所述表面活性剂为非离子型的、两性离子型的 或阳离子型的。24. 根据权利要求23所述的方法，其中所述阳离子型表面活性剂为鲸蜡基三甲基溴化 铵。25. 根据权利要求24所述的方法，其中鲸蜡基三甲基溴化铵以约0. 001 %到0. 05%、或 约0. 005%到0. 025%、或约0. 0075%到约0. 01 %的范围的浓度存在。26. 根据权利要求1-25中任一项所述的方法，其中所述一种或多种官能化基底包含选 自组由阴离子型、阳离子型或两性离子型组成的组的至少一种电荷配置。27. 根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中所述金属结合官能团和所述阳离子 型官能团位于不同的基底上。28. 根据权利要求1-27中任一项所述的方法，其中所述金属结合官能团也是阳离子型 的。29. 根据权利要求1-28中任一项所述的方法，其中所述金属结合官能团包括选自由以 下组成的组中的一种：三（2-氨乙基）胺、二亚乙基三胺、三亚乙基三胺、四亚乙基五胺、聚 丙烯亚胺四胺、聚（酰胺基胺）（PAMAM)树状物、去铁胺、精氨酸、组氨酸、组胺、咪唑和其组 合。30. 根据权利要求1-28中任一项所述的方法，其中所述金属结合官能团为式I化合 物：其中R在每次出现时独立地为氢或烷基，前提是至少一个R为与固体载体连接的 位点，任选地经由连接体与固体载体连接；并且 X、Y和Z中的每一个独立地为（CH2)n，其中η为2到6的整数，其中CH2基团任选地被 0或NH替代。31. 根据权利要求30所述的方法，其中所述阳离子型螯合剂为三（2-氨乙基）胺。32. 根据权利要求1-31中任一项所述的方法，其中所述金属结合官能团和阴离子型官 能团位于不同的基底上。33. 根据权利要求1-31中任一项所述的方法，其中所述金属结合官能团为阴离子型 的。34. 根据权利要求33所述的方法，其中所述金属结合官能团选自由以下组成的组：亚 氨基二乙酸、次氮基乙酸、谷氨酸、天冬氨酸、氨基苯基磷酸盐和其组合。35. 根据权利要求34所述的方法，其中所述阴离子型螯合剂为亚氨基二乙酸。36. 根据权利要求1-35中任一项所述的方法，其中所述一种或多种官能化基底包含一 种为阳离子型的基底和为阴离子型的不同基底。37. 根据权利要求1-36中任一项所述的方法，其中所述抗体为IgG抗体或IgM抗体。38. -种用于纯化抗体的方法，其包括： 使细胞培养收获物或蛋白质制剂与具有8到10个碳原子的至少一种脂肪酸接触以形 成混合物； 使所述混合物与尿囊素接触；和 在使所述混合物与尿囊素接触之后分离固体材料，以提供包含所述抗体的溶液。39. 根据权利要求38所述的方法，其进一步包括使所述溶液与至少一种化学官能化的 固体或可溶性基底接触。40. 根据权利要求39所述的方法，其中所述至少一种化学官能化固体包含三（2-氨乙 基）胺。41. 根据权利要求38-40中任一项所述的方法，其中尿囊素以选自由以下组成的组的 范围的浓度存在：(a)约0· 6%到约30%、（b)约1%到约10%、（c)约1%到约5%和（d) 约1 %到约2%。42. 根据权利要求38-40所述的方法，其中尿囊素在非零量到高达约0. 6%的范围。43. 根据权利要求38-42中任一项所述的方法，其中所述抗体为IgG抗体或IgM抗体。44. 一种有助于实施权利要求1-43的任一方法的试剂盒。
【专利摘要】一种纯化靶蛋白质的方法包括使包含至少一种靶蛋白质的细胞培养收获物或蛋白质制剂与具有8到10个碳原子的至少一种脂肪酸接触以形成混合物，使所述混合物与一种或多种固体接触以形成混合物，所述一种或多种固体包含阳离子型官能团、金属结合官能团或两者，所述结合金属的官能团包含选自以下的含氮部分：(1)聚胺、(2)亚胺、(3)N-杂环、(4)氨基酸、(5)N-羟基酰胺、(6)芳基胺和其组合；和在使所述混合物与所述一种或多种固体接触之后分离固体材料，以提供包含所述靶蛋白质的溶液。
【IPC分类】C07K1/30, C07K1/36
【公开号】CN105263946
【申请号】CN201480031955
【发明人】彼得·斯坦利·加尼翁
【申请人】新加坡科技研究局
【公开日】2016年1月20日
【申请日】2014年2月27日
【公告号】EP3004135A1, US20160115194, WO2014196926A1