FI ：TCATATGCTTACCGTAACTTGAAAG(SEQ ID NO:67)
[0059] R1 ：CCAATTCCCACTCCTTTCAAG(SEQ ID NO:68)
[0060] 反应体系为：缓冲液，2. 5ul ;dNTP，2. 5ul ;ExTaq(TaKaRa)，0. 15ul ;稀释菌液， lul ;引物 F1/R1，0. 3ul ;ddH20，18. 25ul。
[0061] PCR 的条件为：37°C 30min ;94°C 5min ; (94°C 30s ;68°C 30s ;72°C 45s)22 个循环； 72°C 8min ;置于4°C下保存待用。
[0062] 测序验证质粒序列的正确性。
[0063] (6)37°C摇床过夜培养阳性克隆，并用质粒小提试剂盒（TIANGE，DP106-02)抽提 质粒，获得表达sgRNA的重组质粒U6-CXCR4sgRNA-EFla-Ne〇-WPRE(见图1，其中一种的序 列如SEQ ID N0:69所示，将SEQ ID N0:69的第2858-2970位替换不同的sgRNA编码序列 可以获得表达实施例1中各个sgRNA的重组质粒）、表达StlCas9的重组质粒U6-EFla-NLS -StlCas9-2A-Pur〇-WPRE(见图 2,其中一种的序列如 SEQ ID N0:70 所示，将 SEQ ID N0:70 的第3815-7276位替换不同的Cas9编码序列可以获得表达不同Cas9的重组质粒）以及共 同表达 StCas9 和 sgRNA 的重组质粒 U6-CXCR4sgRNA-EFla-NLS-StlCas9-NLS-2A-Pur〇-WPR E (见图3,其中一种的序列如SEQ ID NO: 71所示，将SEQ ID NO: 71的第2858-2970位替换 不同的sgRNA编码序列且第4169-7630位替换不同的Cas9编码序列可以获得表达实施例 1中的各个sgRNA和不同Cas9的重组质粒）。
[0064] 实施例3
[0065] 本实施例用来说明使用本发明的CRISPR_Cas9系统编辑CXCR4基因的方法。
[0066](一）细胞培养和转染
[0067] (1)将HEK293T细胞（CBR-130005,购自上海赛齐生物工程有限公司）在DMEM高 糖培养基（含有10%的FBS、青霉素（penicillin，100U/ml)和链霉素（streptomycin， 100μg/ml))中进行培养；
[0068] (2)转染前分至六孔板中，细胞密度达70 %时进行转染；
[0069] (3)按照 Lipofectamine 3000 (Invitrogen，11668-019)用量比例，使 用 3yg 的 U6-CXCR4sgRNA-EFla-NLS-StlCas9-NLS-2A-Pur〇-WPRE、或者 1.5yg 的 U6-CXCR4sgRNA-EFla-Ne〇-WPRE 和 1. 5 μ g 的 U6-EFla-NLS-StlCas9-NLS-2A-Pur〇-WPRE 组 合转染每孔细胞，8h后换液，相应的，加入噪呤霉素（Puromycin)和G418(Geneticin)进行 药筛，48h后收取细胞。
[0070] (二）TA克隆测序检测：
[0071] ⑴将收集的细胞在裂解液（10 μΜ Tris-HCl，0. 4M NaCl，2 μΜ EDTA，1% SDS)中， 用100 μ g/ml蛋白酶Κ裂解消化后，酚-氯仿抽提后溶解到100 μ 1去离子水中；
[0072] (2)使用引物F2/R2进行PCR扩增，使用试剂盒（TIANGEN，DP080822)纯化PCR回收 产物，其中，F2 :CCCTTAGCCCACTACTTCAG(SEQ ID N0:72)，R2 :ACATCTGTGTTAGCTGGAGTG(SEQ ID NO :73)；
[0073] (3)将获得的PCR回收产物用rTaq进行加 A反应，体系为：
[0074] SOOng PCR回收产物 5μ1 HKBuiTcr ( 3μΙ Mg -
[0075] 4μΙ dNTP 0.5μ! rTaq ( TAKARA5 加入ddH:0到50μL
[0076] 37°C温浴30min，取1 μ 1产物与pMD19-T载体（TAKARA，3271)连接（连接方式参 见PMD19-T载体的说明书）并转化ToplO感受态细胞（购自博迈德生物技术有限公司）。
[0077] (4)挑取单克隆进行测序，根据测序结果发现：革巴基因 CXCR4在sgRNA靶向的序列 处出现了缺失和插入（indel)，导致CXCR4发生移码突变，基因敲除成功。其中，针对识别序 列对应的DNA序列为SEQ ID N0:2且招募Cas9蛋白的序列为SEQ ID N0:64的sgRNA处理 后的单克隆的测序结果如图4所示（其中，箭头表示Csa9切割位点，随机挑选53个克隆， 一共检测到9个克隆携带引起移码或者提前终止的突变，突变率为9/53 = 16. 9% )。
[0078] 从以上实施例可以看出，本发明的CRISPR-Cas9(CRISPR_StlCas9)系统能够实现 人CXCR4基因的敲除，且敲除效率也较高。
[0079] 以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中 的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这 些简单变型均属于本发明的保护范围。
[0080] 另外需要说明的是，在上述【具体实施方式】中所描述的各个具体技术特征，在不矛 盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可 能的组合方式不再另行说明。
[0081] 此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本 发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
【主权项】
1. 一种CRISPR-Cas9系统识别的靶序列，其特征在于，所述靶序列如SEQIDNO: 1-63 中任意一个的第n-20位所示且η= 1-5。2. -种sgRNA，该sgRNA的序列为：5' -识别序列-招募Cas9蛋白的序列-3'，其特征 在于，所述识别序列对应的DNA序列如SEQIDNO: 1-63中任意一个的第n-20位所示且η =1-5〇3. 根据权利要求2所述的sgRNA，其中，招募Cas9蛋白的序列如SEQIDΝ0:64所示。4. 根据权利要求2或3所述的sgRNA，其中，所述识别序列对应的DNA序列如SEQID NO: 2或53所示且招募Cas9蛋白的序列如SEQIDNO:64所示。5. 编码权利要求2、3或4所述的sgRNA的DNA分子。6. -种CRISPR-Cas9系统，其特征在于，该CRISPR-Cas9系统包括：Cas9蛋白和sgRNA， 和/或携带有Cas9蛋白的编码序列和sgRNA的编码序列的载体，所述Cas9蛋白的编码序 列和sgRNA的编码序列位于相同或不同的载体上，其中，所述sgRNA为权利要求2、3或4所 述的sgRNA且所述Cas9蛋白源自嗜热链球菌（Streptococcusthermophilus)。7. 根据权利要求6所述的CRISPR-Cas9系统，其中，所述sgRNA为权利要求4所述的 sgRNA〇8. -种编辑CXCR4基因的方法，其特征在于，该方法包括：将权利要求6或7所述的 CRISPR-Cas9系统导入表达CXCR4的细胞中。9. 根据权利要求8所述的方法，其中，所述细胞来源于灵长类动物，优选来源于人。10. 权利要求6或7所述的CRISPR-Cas9系统在制备用于预防和/或治疗HIV感染的 药物中的应用。
【专利摘要】本发明属于基因工程领域，公开了一种源自嗜热链球菌的CRISPR-Cas9系统识别的靶序列，其序列如SEQ？ID？NO:1-63中任意一个的第n-20位所示且n＝1-5。本发明还公开了序列为5’-识别序列-招募Cas9蛋白的序列-3’的sgRNA及其编码DNA分子，识别序列对应的DNA序列与靶序列相同。本发明还公开了一种CRISPR-Cas9系统，包括Cas9蛋白和sgRNA和/或携带有Cas9蛋白的编码序列和sgRNA的编码序列的载体。本发明还公开了CRISPR-Cas9系统在编辑CXCR4基因和制备用于HIV感染的药物中的应用。本发明可以实现CXCR4基因的编辑，使得细胞无法被HIV感染。
【IPC分类】C12N15/113, C12N15/11, C12N9/22, A61K31/7088, A61P31/18
【公开号】CN105316324
【申请号】CN201510693081
【发明人】张竞方, 秦小平
【申请人】芜湖医诺生物技术有限公司
【公开日】2016年2月10日
【申请日】2015年10月20日