005_3 基因的 cDNA 序列出发，利用 Cereal sDB和 IWGSC (Internat1nal Wheat Genome Sequencing Consortium)公布的普通小麦的测序信息，以及2013年Nature上发表的小麦祖先乌拉尔图小麦(Triticum urartu, A基因组供体)和粗山羊草(Aegilops tauschii，D基因组供体)的测序信息进行电子克隆，获得了 TaASG005-l、TaASG005-2和TaASG005_3基因的启动子，分别命名为TaASG005_l启动子、TaASG005-2启动子和TaASG005_3启动子，其长度分别为2032bp、2047bp和2009bp，序列分别如 SEQ ID N0:5、SEQ ID N0:6 和 SEQ ID N0:7 所示。
[0059]利用PlantCARE数据库和PLACE数据库，对TaASG005_l启动子、TaASG005_2启动子和TaASG005-3启动子进行顺式元件分析。如图3所示，翻译起始位点ATG用粗体下划线表示，以翻译起始位点ATG的A定义为“+1”，AGAAA基序用阴影表示，GTGA基序用方框表示。TaASG005-l启动子中有6个AGAAA基序、4个GTGA基序，TaASG005_2启动子中有5个AGAAA基序、6个GTGA基序，TaASG005_3启动子中有3个AGAAA基序、4个GTGA基序。AGAAA基序和GTGA基序是与花粉/花药特异表达相关的顺式调控元件，TaASG005_l启动子、TaASG005-2启动子和TaASG005_3启动子中多个AGAAA基序和GTGA基序的存在表明该启动子可能是与花粉/花药特异表达有关的启动子。
[0060]实施例4.TaASG005-3启动子的克隆和植物表达载体的构建
[0061]将植物表达载体pBI121用限制性内切酶Hindlll和EcoRI双酶切，得到的35S:⑶S片段用T4DNA ligase连入同样用Hindlll和EcoRI双酶切的CAMBIA公司的PCAMBIA2300载体，新的载体被命名为p230035S:⑶S。
[0062]由于TaASG005启动子序列中有GC含量较高的区段，故分两段获得。
[0063]片段1的扩增引物为:
[0064]引物7:5，-ctgcag TGTCCGGAGACGGCGGGAGC-3，
[0065]引物8:5，-actagt CCCGGGTGCCCATACACCTCATG-3’
[0066]片段长度为942bp，片段前端为PstI (ctgcag)酶切位点，片段末端为Smal (CCCGGG)和Spel (actagt)酶切位点。以小麦的基因组DNA为模板，用引物7和引物8进行扩增，反应体系中需按照1:3的比例加入dC7GTP和dGTP以提高对高GC片段的扩增效率。反应条件是:94°C预变性5分钟；94°C变性30秒；60°C退火30秒；72°C延伸1分钟；35个循环；72°C延伸10分钟。反应结束后，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测回收，产物连入pEASY-Tl-Simple载体中，筛选阳性克隆并进行测序验证，该质粒称为p237。
[0067]片段2的扩增引物为:
[0068]引物9:5，-CCCGGGAGCTGTTACAACTTTC-3，
[0069]引物10:5，-actagt TGCTACACTCTGGTCTCTGGAGTAGC-3，
[0070]片段长度为1064bp，片段前端为Smal (CCCGGG)酶切位点，片段末端为Spel (actagt)酶切位点。以小麦的基因组DNA为模板，用引物9和引物10进行扩增，反应条件是:94°C预变性5分钟；94°C变性30秒；60°C退火30秒；72°C延伸1分10秒；35个循环；72°C延伸10分钟。反应结束后，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测回收，产物连入pEASY-T-Blunt-Simple载体中，筛选阳性克隆并进行测序验证，该质粒称为p238。
[0071]将p237用Smal和Spel进行双酶切，回收载体；将p238用Smal和Spel进行双酶切，回收TaASG005启动子的片段2 ;将上述两者用T41igase进行连接，得到质粒p245，上面带有TaASG005启动子的全长。
[0072]用限制性内切酶PstI和Spel双酶切p245，得到的TaASG005_3启动子，用T4DNAligase连入用PstI和Xbal双酶切的p230035S:⑶S载体，得到植物表达载体p247，该质粒的结构如图4所示。
[0073]实施例5.农杆菌介导的水稻遗传转化及转基因植株的分子鉴定
[0074]利用热激法将植物表达载体p247转入农杆菌AGL0菌株。
[0075]用农杆菌侵染水稻胚性愈伤，暗中共培养2-3天，然后经过两步抗性筛选、预分化、分化和生根培养等步骤，最终获得具有卡那霉素抗性的、转P247水稻??代植株。
[0076]设计引物对转基因水稻植株进行PCR鉴定。
[0077]引物9:5，-CCCGGGAGCTGTTACAACTTTC-3’
[0078]引物11:5，-GCCGTCGAGTTTTTTGATTTCAC-3，
[0079]反应条件为:94°C预变性5分钟；94°C变性30秒；55°C退火30秒；72°C延伸1分30秒；30个循环；72°C延伸10分钟。扩增的是TaASG005-3启动子和⑶S的部分片段，长度为1113bp。鉴定结果表明，利用农杆菌介导的水稻转化获得的抗性再生植株是转p247基因的阳性植株。
[0080]实施例6.转基因水稻植株不同组织器官⑶S基因表达的组织化学检测
[0081]X-Gluc 母液:100mg X-Gluc 溶于 5ml DMF。
[0082]X-Gluc 基液:50mM PBS pH7.0，lOmM EDTA.2Na，0.1 % Triton X-100，5mM 铁氢化钾，0.5mM亚铁氢化钾。
[0083]X-Gluc 使用液:δ0 μ 1 母液 +%0 μ 1 基液。
[0084]选择合适大小的带有⑶S报告基因的转基因幼苗或特定组织浸入⑶S染液中，37°C染色过夜，吸去反应液，乙醇梯度脱色，显微镜观察照相。
[0085]对p247转基因水稻植株各组织器官的⑶S染色结果如图5，在转基因水稻的根、茎和叶等营养器官中都检测不到GUS基因的表达(图5A-C)，在花粉处于减数分裂期的穗子和花粉处于单核期、双核期和三核期的除花药以外的其它花器官中也检测不到GUS基因的表达，TaASG005-3启动子只能启动⑶S基因在花粉处于单核期、双核期和三核期的花药中表达，其中三核期花粉中表达最强(图OT-K)，说明TaASG005-3启动子是一个花粉发育晚期花药特异表达的启动子。
【主权项】
1.一种启动子，具有花药特异表达的特性，其特征在于所述启动子的核苷酸序列选自下列组的序列之一: (a)具有SEQID NO:5、6或7所示的序列； (b)在严格条件下能够与(a)所述序列的DNA杂交的DNA序列； (c)包含SEQID NO:5,6或7中至少100个连续核苷酸的DNA序列；和 (d)与(a)- (c)之任一所述序列互补的DNA序列。2.—种表达盒，具有在花药中特异表达的特性，其特征在于所述表达盒包含权利要求1所述的启动子序列。3.—种表达载体，其特征在于所述表达载体包含权利要求2所述的表达盒。4.一种工程菌，其特征在于所述工程菌含有权利要求3所述的表达载体。5.一种在植物中表达目的核苷酸序列的方法，所述方法包括向植物体导入DNA构建体，所述DNA构建体含有启动子及操作性连接于所述启动子的目的核苷酸序列，其中所述启动子的核苷酸序列选自下列组的序列之一: (a)具有SEQID NO:5、6或7所示的序列； (b)在严格条件下能够与(a)所述序列的DNA杂交的DNA序列； (c)包含SEQID NO:5,6或7中至少100个连续核苷酸的DNA序列；和 (d)与(a)- (c)之任一所述序列互补的DNA序列。6.权利要求5所述的方法，其中所述的植物为单子叶植物，优选为禾本科植物，更优选的为水稻或小麦。7.权利要求5所述的方法，其中所述的目的核苷酸序列可以是结构基因、调节基因、结构基因的反义基因、调节基因的反义基因或者能够干扰内源基因表达的小RNA，其在花粉发育晚期的特异性表达可以调节花粉的育性及花粉萌发。8.权利要求5所述的方法，其中所述的目的核苷酸序列可以是编码促使碳水化合物降解的酶或修饰酶、淀粉酶、脱支酶和果胶酶，更具体的如玉米a淀粉酶基因、生长素，rotB、细胞毒素基因、白喉毒素、DAM甲基化酶、亲和素，或者可选自原核调控系统，还可以是显性的雄性不育基因。9.权利要求1所述的启动子在以下(a)至(d)中任一项中的应用: (a)培育植物品种或品系； (b)培育授粉受精能力增强植物品种或品系； (c)培育授粉受精能力消弱的植物品种或品系； (d)培育雄性不育植物品种或品系。10.权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的植物为单子叶植物，所述单子叶植物优选为禾本科植物，更具体的，所述禾本科植物优选为水稻或小麦。
【专利摘要】本发明公开了一个植物花药特异表达启动子pTaASG005的鉴定和应用，属于植物生物技术领域，具体涉及该植物花药特异表达启动子的分离和功能鉴定及应用。本发明所公开的启动子在植物的花药中特异表达，具体是在花粉处于单核期、双核期和三核期的花药中特异表达，在植物转基因领域具有很好的应用前景。
【IPC分类】C12N15/113, A01H5/00, C12N15/82, C12N1/21
【公开号】CN105316333
【申请号】CN201510389098
【发明人】李健, 马力耕, 邓兴旺
【申请人】未名兴旺系统作物设计前沿实验室（北京）有限公司, 河北博农农业技术开发有限公司, 兴旺投资有限公司
【公开日】2016年2月10日
【申请日】2015年7月3日