一种同时检测对虾hpv、mbv和ihhnv的多重pcr检测引物、试剂盒及用图
【专利说明】—种同时检测对虾HPV、MBV和丨HHNV的多重PCR检测引物、
试剂盒及用途
技术领域
[0001]本发明涉及海洋生物病原检测技术，具体涉及一种同时检测对虾肝胰腺细小病毒(Hepatopancreatic parvovirus, HPV)、斑节对4下杆状病毒(Monodon baculovirus, MBV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(Infect1us hypodermal and hematopoietic necrosisvirus, I HHNV)的多重PCR检测引物、试剂盒及用途。
【背景技术】
[0002]对4下肝胰腺细小病毒(Hepatopancreatic parvovirus, HPV)属于细小病毒科，浓核病毒亚科，平均直径22-23 nm，有包涵体，单链DNA病毒(ssDNA)，无包膜二十面体。其在病毒学中属于慢性感染类型，传染性强，发病率高。对虾感染肝胰腺细小病毒后，肝胰腺上皮细胞肿大，变性，尤其在疾病充分发展期的病虾肝胰腺、鳃组织，以及后胃和前中肠粘膜层细胞坏死解体，最后肝胰腺仅剩下一团结缔组织，以至病虾失去消化吸收功能，呼吸器官也遭到严重损害，造成窒息而死。
[0003]对虾肝胰腺细小病毒是已知的导致对虾生长缓慢的主要细小病毒之一。HPV已在世界各地的野生对虾和养殖对虾中被发现。其致病率高，分布广，对对虾养殖业可造成巨大的经济损失。HPV很少单独感染对虾，多与其他多种病原性的病毒发生混合感染，并且在大多数情况下，重感染的对虾却没有明显的炎症反应。致病虾生长变缓、活动呆滞、食欲减退、较少蜕皮，虾体表常有杂物附着；成虾甲壳变软，腹部肌肉变白，常并发二次性细菌感染，以弧菌较为常见。迄今为止，还没有有效的预防措施可减少对虾的感染。
[0004]斑节对4下杆状病毒(Monodon baculovirus, MBV)又名草?!下杆状病毒病(grassshrimp baculovirus )、因首次在斑节对4下(/fewaeiA?/wwoi/oi?)中发现而得名。1987-1988年MBV在台湾等地区爆发流行，1991年在大陆发现。在中国、泰国、新加坡、印度尼西亚、马来西亚均有广泛分布。
[0005]斑节对虾杆状病毒属杆状病毒科，核型多角体病毒属A亚群。病毒为杆状，有囊膜，有包涵体，为双链DNA病毒(dsDNA)。核衣壳大小为42X246 nm，连囊膜大小约为75X324 nm。不同种类的虾所观察到的病毒颗粒大小略有差异。斑节对虾杆状病毒感染部位是肝胰腺及前中肠的上皮细胞核，并在细胞核内产生多个嗜酸性的圆形或椭圆形的病毒包涵体。
[0006]致病虾食欲减少，活动呆滞，鳃、附肢和体表常带有大量的附生生物。受感染后幼体除部分体色加深外，并无特别症状，多数携带病毒的虾活动正常。受感染幼体群常常无明显的症状表现而出现大量死亡，更因继发感染其它病毒、细菌或附生物而导致幼体大量死亡。
[0007]传染性皮下及造血组织坏死病毒(Infect1ushypodermal and hematopoieticnecrosis virus,简称IHHNV)最初于1981年在美国夏威夷地区养殖细角滨对4下{Litopenaeus stylirostris)中被发现(Lightner et al，1983)。
[0008]传染性皮下及造血组织坏死病毒是世界各地养殖和野生对虾的重要病原之一，属于细小病毒科{ParvoviridaS)短浓核症病毒属(Brevidensovirus')。是目前已知的对4下病毒中颗粒最小的一种，直径22 nm，单链DNA细小病毒(ssDNA Parvovirus)无包膜，20面体对称的球状颗粒。IHHNV感染对虾的部位，包括外胚层组织，如鳃、表皮、前后肠上皮细胞、神经索和神经节，以及中胚层器官，如造血组织、触角腺、性腺、淋巴器官、结缔组织和横纹肌。在宿主细胞核内形成包涵体。患此病的病虾身体变形，引起慢性感染为主。死亡率不高，但严重影响经济效益。
[0009]IHHNV的敏感宿主是细角滨对4下(Litopenaeus stylirostris)和凡纳滨对4下{Penaeus ，自然状态下可感染大部分养殖对虾，引起细角滨对虾的发病和死亡，在凡纳滨对4下，贝>J表现为慢性矮小残缺综合症(runt-deformity syndrome, RDS)。同时也是南美白对虾常见的一种慢性致病病毒。
[0010]在人工养殖中，对虾可同时感染多种病毒。HPV和MBV在虾类养殖业中经常出现混合感染，给对虾养殖业及海洋资源的可持续发展带来严重威胁。因此，对病毒进行检测和监控就显得意义非常重大。
[0011]目前，对虾病毒病的诊断手段主要包括病理学和生物学方法、免疫诊断法，分子杂交及PCR。已建立的常规PCR技术，常是一次只能检测一种样本，比较费时间。而多重PCR技术是一种特殊的PCR方法，在一个反应体系中加入多对病毒特异性引物，能够同时检测多种病原体，从而缩短病毒检测的周期，提高检测效率。但多重PCR检测也受多种因素的影响，比如DNA聚合酶的活性、模板的质量、所设计的病毒引物的特异性、PCR反应条件、不同病毒样本间对试剂的竞争等因素都会影响检测结果的敏感性和准确性。
[0012]基于当前现状，需建立一种准确、快速、简便的对虾病毒检测方法，以利于对病毒的早期诊断，便于及时采取有效的防治措施。
【发明内容】
[0013]本发明的目的在于提供一种方便快捷，检测限低，且特异性强、灵敏度高、准确率高、且能同时检测对虾肝胰腺细小病毒、斑节对虾杆状病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒的多重PCR检测方法。
[0014]为实现上述目的，本发明提供一种同时检测对虾肝胰腺细小病毒、斑节对虾杆状病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒的多重PCR引物，其特征在于，所述引物分别为HPV-F 和 HPV-R、MBV-F 和 MBV-R、IHHNV-F 和 IHHNV-R，序列如 SEQ ID N0:1 和 2，SEQ IDNO:3 和 4，SEQ ID NO:5 和 6 所示。
[0015]一方面，本发明还提供一种用于同时检测对虾肝胰腺细小病毒、斑节对虾杆状病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒的多重PCR检测试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的引物对。
[0016]另一方面，提供所述多重PCR引物或所述多重PCR检测试剂盒中的引物检测对虾肝胰腺细小病毒、斑节对虾杆状病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒的用途。
[0017]另一方面，提供多重PCR引物或所述多重PCR检测试剂盒中的引物检测对虾肝胰腺细小病毒、斑节对虾杆状病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒的方法。
[0018]进一步，步骤为， 提取DNA，
PCR检测，采用权利要求1的多重PCR引物或权利要求2的多重PCR检测试剂盒中的引物；阳性对照为SEQ ID NO: 7，SEQ ID NO: 8和SEQ ID NO: 9的核酸序列混合作为模板，阴性对照为:不含有对虾肝胰腺细小病毒、斑节对虾杆状病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒任一病毒的任意DNA核酸序列；
结果判定，
当检测样本和阳性对照的扩增条带大小接近，为90-120bp时，结果为对虾肝胰腺细小病毒阳性；如果没有90-120bp条带，则为对虾肝胰腺细小病毒阴性；
当检测样本和阳性对照的扩增条带大小接近，为180-220bp时，结果为斑节对虾杆状病毒阳性；如果没有180-220bp条带，则为斑节对虾杆状病毒阴性；
当检测样本和阳性对照的扩增条带大小接近，为270-320bp时，结果为传染性皮下及造血组织坏死病毒阳性；如果没有270-320bp条带，则为传染性皮下及造血组织坏死病毒阴性；
当阴性对照出现条带时，表明操作过程中有试剂污染，检测结果无效；
当阳性对照无条带时，表明引物或者试剂盒中相关试剂降解，引物或试剂盒失效。
[0019]进一步，所述PCR检测的PCR反应体系为:25 μ L反应体系中包含有10倍浓度的含镁离子的Taq DNA聚合酶缓冲液2.5 μ L，Taq DNA聚合酶0.5 μ L，各引物终浓度为0.4μ Μ，提取好待检测的DNA模板1 μ L。
[0020]进一步，所述PCR检测