斑节对虾杆状病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒的特异性引物。本发明通过对所设计的引物进行实验筛选，筛选出一组同时对肝胰腺细小病毒、斑节对虾杆状病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒具有非常高的灵敏性和特异性的引物，引物序列如下:
对虾肝胰腺细小病毒
上游引物:HPV-F: CAA TTA GAA CGC ΑΤΑ GAA AAC G SEQ ID NO:1 下游引物:HPV-R:CCG CAC TTA CCT CTT GTC TCSEQ ID NO:2
斑节对虾杆状病毒
上游引物:MBV-F: GCA AGA CCC TCT ACC GAT ATGSEQ ID NO:3
下游引物:MBV-R:AAG GAG TGC AGA TCT TGA AAA TSEQ ID NO:4
传染性皮下及造血组织坏死病毒
上游引物:IHHNV-F: ACA GCA GCA AAC TAT GAA GAC C SEQ ID NO:5 下游引物:IHHNV-R:GCA GCC AAG TTT AAG TTC GTSEQ ID NO:6
阳性质控品:包括对虾肝胰腺细小病毒、斑节对虾杆状病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒的核酸DNA。分别为人工合成(生工生物工程(上海)股份有限公司，以下均同此)含有上述引物扩增目的片段的如下序列:
HPV:CAATTAGAACGCATAGAAAACGCTAAGAAATACATAGAAGAAGTTATAGAAGAAACTAATCAAGAGTTAGAAAATCAAGAGAGACAAGAGGTAAGTGCGGCGGAGGCAGATACGATGAACACTGAAGCACCTGTCCCGATGGAAACTTCTGAATCAGGGACTACCGCCGCACCGCAGCAGCGAGCTGCAGCGGGCGGTGGCGGTAGTGGAGGTGGAGGCGAATCAGCAGGGTACGGGAGAAACTCTAGCGATTCATTCCAGCGCCACCGCAACAAACCTATCGATCT SEQ ID NO:7 ；
MBV:ACCATAAGCTAGCATACGTCCTTTTGAATTTTTATACTGTTCTATGCATTTTGCAAGACCCTCTACCGATATGGTATCAATGTCTGGAGTTATATTATTTTTTATATAATTGAGTGTTTTTTGCTGACCTTTTGAAATTGCATTTTTATAGATAAATAAAGAATCATCGAGATCCTTCATTTATAATTGTCTTTATCTTTTTGTATAGCGTGTTAACGCTATAAAGATTTTCAAGATCTGCACTCCTT SEQ ID NO:8 ；
IHHNV:TCACATTTACAGACACCCCATATTTAGAAATATTTAAGGATACTACTGGACTACATAATCAACTATCAACTAAGGAAGCCGACGTAACATTGGCAAAATGGATACAAAATCCCCAACTTGTGACCGTACAATCAACAGCAGCAAACTATGAAGACCCAATCCAACAATTTGGATTCATGGAACAAATGCGAACCGGTGACAGAAAAGCCTATACAATCCATGGTGACACTAGAAATTGGTATGGCGGAGAAATACCAACAACCGGACCCACCTTCATCCCAAAATGGGGTGGTCAATTAAAATGGGACAAACCATCCCTTGGAAACCTAGTCTACCCAGCAGACCACCATACAAACGACTGGCAACAGATCTTCATGAGAATGTCACCAATCAAAGGACCAAATGGAGACGAACTTAAACTTGGCTGC SEQ ID NO:9。
[0029]阴性质控品:不含HPV、MBV或IHHNV这三种病毒的任何DNA质粒
以上三种病毒核酸片段分别转入载体后，挑取阳性克隆菌落培养并提取质粒测其浓度后作为阳性质控品。
[0030]检测方法及步骤:
病毒核酸DNA的提取:
取疑似对虾肝胰腺细小病毒、斑节对虾杆状病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒等病毒发病对虾内脏组织约0.lg，加入400 yL裂解液(15 mmol/L NaCl，10 mmol/LTris-HCl, 10 mmol/L EDTA, 1% SDS, pH8.0)研磨均匀，加入蛋白酶K，终浓度为 100 μ g/ml，震荡混匀后于55°C温育l_2h。在反应液中加入等体积的苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)混勾，去除残余蛋白，10000 r/min离心10 min后取上清，加入等体积氯仿:异戊醇(24:1)混勾，10000 r/min离心10 min，转移上层水相，加入1/10体积3 mol/L乙酸钠(pH 5.2)，再加入2倍体积无水乙醇，混勾，12000 r/min离心5 min，沉淀用75%冷乙醇洗涤2次，室温晾干后加入50 yL TE，于-20°C保存备用。
[0031]多重PCR扩增:
所述的多重PCR反应体系为25 μ L，反应体系中包含有10倍浓度的含镁离子的TaqDNA聚合酶缓冲液2.5 μ L，Taq DNA聚合酶0.5 μ L，各引物终浓度为0.4 μ Μ，提取好待检测的DNA模板1 yL，纯水补足至25 y L，同时按上述体系设置阳性和阴性对照，加入阳性质控品或阴性质控品1 μL进行扩增。
[0032]将各反应管放入PCR仪的反应槽内，设定多重PCR仪反应程序，进行多重PCR反应。以检测所检测的对虾是否感染对虾肝胰腺细小病毒、斑节对虾杆状病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒。
[0033]设定多重PCR反应条件为:95°C 3分钟，1个循环；95°C 30秒，55°C 30秒，72°C20秒，35个循环；72°C 10分钟，1个循环；4°C保存。
[0034]扩增产物检测与分析:1.5%(ff/V)琼脂糖凝胶电泳检测目的条带并成像分析。
[0035]结果判定:
当检测样本和阳性对照的扩增条带大小一致，为90-120 bp时，结果为对虾肝胰腺细小病毒阳性；
当检测样本和阳性对照的扩增条带大小一致，为180-220 bp时，结果为斑节对虾杆状病毒阳性；
当检测样本和阳性对照的扩增条带大小一致，为270-320 bp时，结果为传染性皮下及造血组织坏死病毒阳性；
当检测样本无条带或条带大小与阳性对照的扩增条带大小不一致，不为90-120 bp时，结果为对虾肝胰腺细小病毒阴性。
[0036]当检测样本无条带或条带大小与阳性对照的扩增条带大小不一致，不为180-220bp时，结果为斑节对虾杆状病毒阴性。
[0037]当检测样本无条带或条带大小与阳性对照的扩增条带大小不一致，不为270-320bp时，结果为传染性皮下及造血组织坏死病毒阴性。
[0038]当阴性对照出现条带时，表明操作过程中有试剂污染，检测结果无效。
[0039]当阳性对照无条带时，表明试剂盒中有相关试剂降解，试剂盒失效。
[0040]
实施例2:同时检测对虾肝胰腺细小病毒、斑节对虾杆状病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒的多重PCR检测引物、试剂盒及检测方法作进一步的效果检测。
[0041]一、敏感性实验
将上述人工合成的阳性质控品进行稀释，依次稀释为1 X 10' 1 X 109、1 X 10s、1 X 10\1 X 106、1 X 105、1 X 104、1 X 103、1 X 102、1 X 101拷贝/ μ L，分别作为多重PCR模板进行敏感性实验。结果见图2-5。
[0042]图1为多重PCR体系中对虾肝胰腺细小病毒检测的敏感性实验结果图。其中Μ为 Takara DL2000 DNA Marker，1-10 为阳性标准品(从 1 到 10 依次为 1 X 1010、1 X 109、1 X 108、1 X 107、1 X 106、1 X 105、1 X 104、1 X 103、1 X 102、1 X 101 拷贝 / μ L)，11 为阴性对照。从图中可以看出，泳道1-10均有约lOObp清晰的PCR扩增条带，对虾肝胰腺细小病毒检测灵敏度达IX 101拷贝/μ L。