的PCR反应条件为:95°C 3分钟，1个循环；95°C 30秒，55°C30秒，72°C 20秒，35个循环；72°C 10分钟，1个循环；4°C保存。
[0021]本发明根据对好肝胰腺细小病毒(Hepatopancreatic parvovirus, HPV)、斑节对4下杆状病毒(Monodon baculovirus, MBV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(Infect1ushypodermal and hematopoietic necrosis virus, IHHNV)的核酸序列，分别设计用于检测肝胰腺细小病毒、斑节对虾杆状病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒的特异性引物。本发明通过对所设计的引物进行实验筛选，筛选出一组同时对肝胰腺细小病毒、斑节对虾杆状病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒具有非常高的灵敏性和特异性的引物，引物序列如下:
对虾肝胰腺细小病毒
上游引物:HPV-F: CAA TTA GAA CGC ΑΤΑ GAA AAC G SEQ ID NO:1 下游引物:HPV-R:CCG CAC TTA CCT CTT GTC TCSEQ ID NO:2
斑节对虾杆状病毒
上游引物:MBV-F: GCA AGA CCC TCT ACC GAT ATGSEQ ID NO:3
下游引物:MBV-R:AAG GAG TGC AGA TCT TGA AAA TSEQ ID NO:4
传染性皮下及造血组织坏死病毒
上游引物:IHHNV-F: ACA GCA GCA AAC TAT GAA GAC C SEQ ID NO:5 下游引物:IHHNV-R:GCA GCC AAG TTT AAG TTC GTSEQ ID NO:6
阳性质控品
阳性质控品:包括对虾肝胰腺细小病毒、斑节对虾杆状病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒的核酸DNA。分别为人工合成含有上述引物扩增目的片段的如下序列:HPV:CAATTAGAACGCATAGAAAACGCTAAGAAATACATAGAAGAAGTTATAGAAGAAACTAATCAAGAGTTAGAAAATCAAGAGAGACAAGAGGTAAGTGCGGCGGAGGCAGATACGATGAACACTGAAGCACCTGTCCCGATGGAAACTTCTGAATCAGGGACTACCGCCGCACCGCAGCAGCGAGCTGCAGCGGGCGGTGGCGGTAGTGGAGGTGGAGGCGAATCAGCAGGGTACGGGAGAAACTCTAGCGATTCATTCCAGCGCCACCGCAACAAACCTATCGATCT SEQ ID NO:7 ；
MBV:ACCATAAGCTAGCATACGTCCTTTTGAATTTTTATACTGTTCTATGCATTTTGCAAGACCCTCTACCGATATGGTATCAATGTCTGGAGTTATATTATTTTTTATATAATTGAGTGTTTTTTGCTGACCTTTTGAAATTGCATTTTTATAGATAAATAAAGAATCATCGAGATCCTTCATTTATAATTGTCTTTATCTTTTTGTATAGCGTGTTAACGCTATAAAGATTTTCAAGATCTGCACTCCTT SEQ ID NO:8 ；
IHHNV:TCACATTTACAGACACCCCATATTTAGAAATATTTAAGGATACTACTGGACTACATAATCAACTATCAACTAAGGAAGCCGACGTAACATTGGCAAAATGGATACAAAATCCCCAACTTGTGACCGTACAATCAACAGCAGCAAACTATGAAGACCCAATCCAACAATTTGGATTCATGGAACAAATGCGAACCGGTGACAGAAAAGCCTATACAATCCATGGTGACACTAGAAATTGGTATGGCGGAGAAATACCAACAACCGGACCCACCTTCATCCCAAAATGGGGTGGTCAATTAAAATGGGACAAACCATCCCTTGGAAACCTAGTCTACCCAGCAGACCACCATACAAACGACTGGCAACAGATCTTCATGAGAATGTCACCAATCAAAGGACCAAATGGAGACGAACTTAAACTTGGCTGC SEQ ID NO:9。
[0022]本发明提供了一种依赖于PCR的分子检测试剂盒及检测方法，为对虾肝胰腺细小病毒、斑节对虾杆状病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒的同时检测提供一种快速、简便、准确的检测方法及试剂盒。通过对引物的设计与筛选，使得检测的灵敏度更高，特异性更好。检测限低至10拷贝/yL，提高了检测水平。所建立的多重PCR体系可重复性好，稳定性强。该试剂盒为对虾肝胰腺细小病毒、斑节对虾杆状病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒的检测提供更有效的检测方法，具有广泛的应用前景。
[0023]本发明所选的3种病毒引物均是对应3种病毒的专用检测引物，特异性强。是本发明的申请人经大量的试验验证后，筛选出的三对具有非常高的特异性的引物，具有非常好的敏感性，检测限低。高通量、低成本、高效率。
[0024]本发明所涉及的三种病毒包括世界各地的病毒株，各自都有多种不同的病毒株，一种病毒的不同病毒株的基因序列有的很保守，有的变异性比较大。并且不同病毒之间还存在交叉反应，在综合比对这些病毒株的序列后，申请人选择了一种病毒不同病毒株之间保守性好的序列，从而能够确保检测出这种病毒的不同病毒株。因此本发明在设计引物时，考虑到一种病毒与其他病毒的基因之间的序列差别，使得在检测时，假阳性率低。避免与其他病毒发生交叉，申请人设计了很多对引物，再进行大量的试验验证，从而筛选出用于本发明的这3对引物。这3对病毒引物彼此间无交叉，且不与其它病毒产生交叉，假阳性率低，能够特异性的检测出分布于世界各地不同地区的3种病毒的病毒株，具有非常好的特异性，广泛适用性和实用性。
[0025]本发明对检测的病毒基因片段无需再进行克隆、测序和序列比对。一次实验即可检测出待测样品中是否含有这三种病毒中的一种、两种或三种。克服了以往单一检测的操作繁琐、灵敏度低、适用性低等诸多限制。
【附图说明】
[0026]图1为多重PCR体系中对虾肝胰腺细小病毒检测的敏感性实验结果图；
图2为多重PCR体系中斑节对虾杆状病毒检测的敏感性实验图； 图3为多重PCR体系中传染性皮下及造血组织坏死病毒检测的敏感性实验图；
图4为多重PCR体系中3种对虾病毒混合检测的敏感性实验图；
图5为多重PCR体系中对虾肝胰腺细小病毒检测的特异性实验图；
图6为多重PCR体系中斑节对虾杆状病毒检测的特异性实验图；
图7为多重PCR体系中传染性皮下及造血组织坏死病毒检测的特异性实验图。
【具体实施方式】
[0027]下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0028]实施例1:检测对虾肝胰腺细小病毒、斑节对虾杆状病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒试验
1)试剂
10 X Taq Buffer:Tris-HCl 100 mM，KC1 500 mM，MgCl2 20 mM，dNTPs 2 mM，Taq 酶 1U/yL ；
引物:HPV-F、HPV-R、MBV-F、MBV-R、IHHNV-F、IHHNV-R 各 10 μ M，纯水，阳性质控品 DNA10 μg/ml ；
本发明根据对好肝胰腺细小病毒(Hepatopancreatic parvovirus, HPV)、斑节对4下杆状病毒(Monodon baculovirus, MBV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(Infect1ushypodermal and hematopoietic necrosis virus, IHHNV)的核酸序列，分别设计用于检测肝胰腺细小病毒、