[0043]图2为多重PCR体系中斑节对虾杆状病毒检测的敏感性实验结果图。其中Μ为Takara DL2000 DNA Marker，1-10 为阳性标准品(从 1 到 10 依次为 1 X ΙΟ10、1 X 109、1 X 10s、1 X 107、1 X 106、1 X 105、1 X 104、1 X 103、1 X 102、1 X 101 拷贝 / μ L)，11 为阴性对照。从图中可以看出，泳道1-10均有约196bp清晰的PCR扩增条带，斑节对虾杆状病毒检测灵敏度达1X101 拷贝 /yLo
[0044]图3为多重PCR体系中传染性皮下及造血组织坏死病毒检测的敏感性实验结果图，其中Μ为Takara DL2000 DNA Marker，1-10为阳性标准品(从1到10依次为1 X 1010、1 X 109、1 X 10s、1 X 107、1 X 106、1 X 105、1 X 104、1 X 103、1 X 102、1 X 101 拷贝 / μ L)，11 为阴性对照。从图中可以看出，泳道1-10均有约294bp清晰的PCR扩增条带，传染性皮下及造血组织坏死病毒检测灵敏度达1 X 101拷贝/ μ L。
[0045]图4为多重PCR体系中3种对虾病毒混合检测的敏感性实验结果图，其中Μ为Takara DL2000 DNA Marker，1-10 为阳性标准品(从 1 到 10 依次为 1 X ΙΟ10、1 X 109、1 X 10s、1 X 107、1 X 106、1 X 105、1 X 104、1 X 103、1 X 102、1 X 101 拷贝 / μ L)，11 为阴性对照。从图中可以看出，从图中可以看出，泳道1-10均有约lOObp、196bp和294bp清晰的PCR扩增条带，再次证明对虾肝胰腺细小病毒、斑节对虾杆状病毒和传染性皮下及造血组织坏死病毒检测灵敏度达IX 101拷贝/ μ L。
[0046]综上所述，可以得出采用本发明的引物及试剂盒，对虾肝胰腺细小病毒检测灵敏度达1 X 101拷贝/ μ L ;斑节对虾杆状病毒检测灵敏度达1 X 10 1拷贝/ μ L ;传染性皮下及造血组织坏死病毒检测灵敏度达IX 101拷贝/ μ L。由结果表明该多重PCR检测方法的灵敏度要高于普通PCR方法。
[0047]二、特异性实验
根据上述的多重PCR检测方法，分别采用对虾肝胰腺细小病毒HPV、斑节对虾杆状病毒MBV、传染性皮下及造血组织坏死病毒IHHNV作模板以及阴性对照进行实验验证，实验结果表明，本发明试剂盒及检测方法特异性较好，未出现假阳性或假阴性，实验结果见图5-图7。
[0048]图5为多重PCR体系中对虾肝胰腺细小病毒检测的特异性实验结果图，其中Μ为Takara DL2000 DNA Marker，1为HPV阳性标准品，2为MBV模板，3为IHHNV模板，4为纯水。采用的引物是HPV引物(HPV-F和HPV-R)，从图中看出，对虾肝胰腺细小病毒为阳性，斑节对虾杆状病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒、纯水均为阴性。说明特异性好。
[0049]图6为多重PCR体系中斑节对虾杆状病毒检测的特异性实验结果图，其中Μ为Takara DL2000 DNA Marker，1为MBV阳性标准品，2为HPV模板，3为IHHNV模板，4为纯水。采用的引物是HPV引物(MBV-F和MBV-R)，斑节对虾杆状病毒为阳性，对虾肝胰腺细小病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒、纯水均为阴性。说明特异性好。
[0050]图7为多重PCR体系中传染性皮下及造血组织坏死病毒检测的特异性实验结果图，其中Μ为Takara DL2000 DNA Marker，1为IHHNV阳性标准品，2为HPV模板，3为MBV模板，4为纯水。采用的引物是HPV引物(IHHNV-F和IHHNV-R)，传染性皮下及造血组织坏死病毒为阳性，对虾肝胰腺细小病毒、斑节对虾杆状病毒、纯水均为阴性。说明特异性好。
[0051]综上所述，可以得出采用本发明的引物及试剂盒具有较好的特异性。
[0052]尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
【主权项】
1.一种同时检测对虾肝胰腺细小病毒、斑节对虾杆状病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒的多重PCR引物，其特征在于，所述引物分别为HPV-F和HPV-R、MBV-F和MBV-R、IHHNV-F 和 IHHNV-R，序列如 SEQ ID N0:1 和 2，SEQ ID NO: 3 和 4，SEQ ID NO: 5 和 6 所示。2.一种用于同时检测对虾肝胰腺细小病毒、斑节对虾杆状病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒的多重PCR检测试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的引物对。3.一种用权利要求1的多重PCR引物或权利要求2的多重PCR检测试剂盒中的引物检测对虾肝胰腺细小病毒、斑节对虾杆状病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒的用途。4.一种用权利要求1的多重PCR引物或权利要求2的多重PCR检测试剂盒中的引物检测对虾肝胰腺细小病毒、斑节对虾杆状病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒的方法。5.权利要求4所述检测对虾肝胰腺细小病毒、斑节对虾杆状病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒的方法，其特征在于，步骤为， 提取DNA， PCR检测，采用权利要求1的多重PCR引物或权利要求2的多重PCR检测试剂盒中的引物；阳性对照为SEQ ID NO: 7，SEQ ID NO: 8和SEQ ID NO: 9的核酸序列混合作为模板，阴性对照为:不含有对虾肝胰腺细小病毒、斑节对虾杆状病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒任一病毒的任意DNA核酸序列； 结果判定， 当检测样本和阳性对照的扩增条带大小接近，为90-120bp时，结果为对虾肝胰腺细小病毒阳性；如果没有90-120bp条带，则为对虾肝胰腺细小病毒阴性； 当检测样本和阳性对照的扩增条带大小接近，为180-220bp时，结果为斑节对虾杆状病毒阳性；如果没有180-220bp条带，则为斑节对虾杆状病毒阴性； 当检测样本和阳性对照的扩增条带大小接近，为270-320bp时，结果为传染性皮下及造血组织坏死病毒阳性；如果没有270-320bp条带，则为传染性皮下及造血组织坏死病毒阴性； 当阴性对照出现条带时，表明操作过程中有试剂污染，检测结果无效； 当阳性对照无条带时，表明引物或者试剂盒中相关试剂降解，引物或试剂盒失效。6.权利要求5所述检测对虾肝胰腺细小病毒、斑节对虾杆状病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒的方法，其特征在于，所述PCR检测的PCR反应体系为:25 μ L反应体系中包含有10倍浓度的含镁离子的Taq DNA聚合酶缓冲液2.5 μ L，Taq DNA聚合酶0.5 μ L，各引物终浓度为0.4 μ M，提取好待检测的DNA模板1 μ L。7.权利要求5所述检测对虾肝胰腺细小病毒、斑节对虾杆状病毒、传染性皮下及造血组织坏死病毒的方法，其特征在于，所述PCR检测的PCR反应条件为:95°C 3分钟，1个循环；95°C 30秒，55°C 30秒，72°C 20秒，35个循环；72°C 10分钟，1个循环；4°C保存。
【专利摘要】本发明公开了一种同时检测对虾HPV、MBV和IHHNV的多重PCR检测引物、试剂盒及用途。所述引物分别为HPV-F和HPV-R、？MBV-F和MBV-R、IHHNV-F和IHHNV-R，序列如SEQ？ID？NO:1和？2，SEQ？ID？NO:3和？4，SEQ？ID？NO:5和？6所示。本发明的引物彼此间无交叉，且不与其它病毒产生交叉，假阳性率低，能够特异性的检测出分布于世界各地不同地区的3种病毒的病毒株，具有广泛适用性，具有非常高的特异性和敏感性，检测限低。同时对检测的病毒基因片段无需再进行克隆、测序和序列比对。一次实验即可检测出待测样品中是否含有这三种病毒中的一种、两种或三种。
【IPC分类】C12N15/11, C12Q1/70, C12Q1/68
【公开号】CN105316330
【申请号】CN201510833901
【发明人】陈明谅, 刘国胜, 陈建明, 杨慧
【申请人】国家海洋局第三海洋研究所
【公开日】2016年2月10日
【申请日】2015年11月26日