分析物富集方法和组合物的制作方法
【专利说明】分析物富集方法和组合物 发明领域
[0001] 公开了用于富集包含分析物的粒子群体的方法和组合物。在一个实施方案中，使 用尺寸大于用于扩增的珠粒的富集珠粒。使用可以保留具有结合的扩增珠粒的较大珠粒的 分离装置。该技术具有许多应用，包括富集具有克隆扩增模板的珠粒，其可以用于各种测定 法，包括核酸测序。
[0002] 背景
[0003] 充分建立了通过聚合酶链反应（PCR)的克隆扩增。分配样品，使得样品内的各核 酸分子定位于许多单独的区内。该步骤可以以不同方式进行，包括在微孔、毛细管、室和乳 剂中的分离。样品分配能够通过限制稀释控制不同分子的数量。例如，为了确保隔室内两个 核酸模板的情况是低频事件，稀释所述模板，使得平均起来每个隔室内少于一个模板分子。 作为结果，每个隔室一般包含"〇"或" 1"个分子；在PCR之后，扩增分别是负的或正的。
[0004] 克隆扩增的一种方法包括在油乳剂中的水性隔室（即液滴）中以限制模板稀释的 固相扩增，其中所述隔室包含粒子（例如珠粒）、模板、核苷酸和核酸扩增。PCR后，一些隔 室包含克隆扩增的珠粒，但是仅为10-20%丰度（由泊松分布控制）。这提出了一个效率问 题。尽管实现了克隆扩增，但只是存在过多的负反应。如果需要进行另一种反应或分析，则 不能对所有珠粒有效地进行，因为仅10-20%含有DNA存在。
[0005] 所需要的是解决这种效率问题的方法。
[0006] 发明概述
[0007] 本发明通过选择性地使具有DNA扩增子的粒子结合富集珠粒（也称作俘获珠粒） 并且分离空白珠粒（即缺乏扩增模板的珠粒）解决了低效率问题。优选实施方案之一在于 在尺寸上大于用于扩增的珠粒的富集珠粒的应用和可以保留具有结合的扩增珠粒的较大 珠粒的分离装置，从而能够使未结合的珠粒流过。在一个实施方案中，富集珠粒被修饰以包 含俘获寡核苷酸（也称作俘获探针）或配体/结合配偶体，赋予它们能够仅结合具有DNA 扩增子的珠粒（也称作"活"珠粒）。在进行最初的分离后，具有扩增子的离子从富集珠粒 中释放。例如，在一个实施方案中，可以使用相同分离装置（例如旋转过滤器）、应用释放溶 液释放它们，所述释放溶液打断扩增的珠粒与富集珠粒之间的相互作用。作为结果，携带扩 增的DNA的珠粒构成总珠粒群体的80-100%，并且作为用于DNA测序或其它下游分析的更 好的样品。并不打算将所述方法或组合物限于核酸方法。该方法和组合物一般适用于任何 分析物。
[0008] 在一个实施方案中，本发明关注富集方法，其包括：a)提供：i)包含一个或多个 (且典型地许多）在油中的水性隔室的乳剂，所述隔室的至少一些包含PCR试剂、固定在乳 剂珠粒上的第一种引物、溶液中的第二种引物、以及模板；和ii)富集珠粒，其中所述富集 珠粒不同于所述隔室中的所述乳剂珠粒；b)使所述乳剂暴露于这样的条件，以便在所述隔 室中的至少一些中的所述乳剂珠粒的至少一些上扩增所述模板的至少一些；c)通过使所 述乳剂珠粒与所述富集珠粒接触来富集包含扩增模板的乳剂珠粒，其中包含扩增模板的所 述乳剂珠粒结合所述富集珠粒，以便构成乳剂珠粒的群体-富集珠粒复合物，且其中不含 扩增模板的乳剂珠粒不结合所述富集珠粒；和d)在这样的条件下俘获至少一些所述复合 物群体，使得不俘获大部分不含扩增模板的所述乳剂珠粒。本发明还包含，在步骤d)后：e) 使复合物的所述群体经历这样的条件，以便使所述包含扩增模板的乳剂珠粒与所述富集珠 粒分离，使得大部分所述包含扩增模板的乳剂珠粒与所述富集珠粒分离。
[0009] 并不打算将本发明限于俘获富集珠粒的方式。在优选的实施方案中，步骤d)中的 俘获包括大小筛选。本发明关注多种大小筛选技术。在一个实施方案中，所述大小筛选包 括密度离心。例如，将复合物置于相对致密的介质（例如甘油）上并且进行离心。在另一 个实施方案中，所述大小筛选包括在使得不俘获大部分所述不含扩增模板的乳剂珠粒且这 些未俘获的珠粒通过所述过滤器的条件下将所述复合物俘获在过滤器上，例如过滤器表面 上（或过滤器主体内）。在一个实施方案中，所述乳剂珠粒在重力下通过。在一个实施方 案中，所述乳剂珠粒在正压下通过（例如使用注射器）。在一个实施方案中，使用力的组合 (例如正压和重力）。在一个实施方案中，所述过滤器定位于旋转柱上且通过离心促进分 离。
[0010] 在一个实施方案中，本发明还关注将复合物俘获在非过滤器表面上。在一个实施 方案中，用配体修饰所述表面，以便俘获珠粒。
[0011] 在一个实施方案中，修饰所述乳剂中的反向引物且其携带然后被并入扩增子的配 体。用结合配偶体包被富集珠粒，所述结合配偶体仅结合携带被配体修饰的扩增子的珠粒。 在一个实施方案中，这类结合配偶体是链霉抗生物素蛋白或抗生物素蛋白，且所述配体是 生物素。
[0012] 并不打算将本发明限于允许扩增的条件。在一个实施方案中，暴露于步骤b)的条 件包括温度循环。
[0013] 如本文所述，在一个实施方案中，控制模板的浓度（例如通过限制稀释），使得每 个隔室包含平均少于一个核酸模板。这将仅扩增一个模板分子的频率最大化，以便生成均 质的扩增模板。
[0014] 在一个实施方案中，本发明还关注在步骤b)之后和步骤c)之前使所述乳剂破裂。 该步骤可以以多种方式进行（下述）并且使得所述乳剂珠粒从其隔室中游离。此外，除去 油。
[0015] 并不打算将本发明限于乳剂珠粒如何结合富集珠粒。在一个实施方案中，俘获寡 核苷酸在富集珠粒上。在另一个实施方案中，结合配体位于富集珠粒上。就后者而言，在一 个实施方案中，本发明关注所述第二种引物包含相互作用对的第一部分，且其中所述富集 珠粒包含所述相互作用对的第二部分。在一个实施方案中，所述相互作用对是生物素和链 霉抗生物素蛋白（或抗生物素蛋白）。在一个实施方案中，所述第二种引物被生物素化，使 得所述扩增模板的一条链终止于生物素，且其中所述富集珠粒包含链霉抗生物素蛋白且所 述包含扩增模板的乳剂珠粒在步骤c)中通过生物素-链霉抗生物素蛋白相互作用结合。
[0016] 如果富集珠粒包含俘获寡核苷酸且乳剂珠粒通过杂交结合富集珠粒（在另一个 实施方案中，图3)，则在所述方法的一个实施方案中，关注在所述破裂步骤后和步骤d)前 使所述扩增模板变性。这在所述乳剂珠粒上生成单链扩增模板，从而允许与所述俘获寡核 苷酸在所述富集珠粒上杂交。例如，所述富集珠粒可以包含俘获寡核苷酸，其包含与所述扩 增模板至少部分互补的序列，使得所述包含扩增模板的乳剂珠粒在步骤c)中通过杂交结 合至所述富集珠粒。
[0017] 如上所述，在一个实施方案中，所述复合物被俘获在过滤器上。在一个优选的实施 方案中，所述过滤器是单层尼龙过滤网（在另一个实施方案中，图11)。为了更高的效率，在 一个实施方案中，关注所述筛网定位于旋转柱上。这能够在步骤d)过程中使所述旋转柱离 心，以便进一步通过促进所述未结合的乳剂珠粒通过所述筛网分离。或者，可以将所述复合 物俘获在过滤器上并且可以通过重力进行分离。在一个实施方案中，本发明关注作为组合 物俘获在过滤器上的复合物。
[0018] 俘获在过滤器上可以有效地进行，其中所述富集珠粒在尺寸上不同于所述乳剂珠 粒。理想地，过滤器应捕集较大的富集珠粒（在与包含扩增模板的乳剂珠粒的复合物中）， 但允许不含扩增模板的较小乳剂珠粒通过过滤器。并不打算将本发明限于乳剂珠粒与富集 珠粒之间的精确尺寸差异。在一个实施方案中，所述富集珠粒至少5倍于且至多100倍于 所述乳剂珠粒。便利地，所述富集珠粒是10与20倍之间大。
[0019] 另外，并不打算将所述复合物限于所涉及的乳剂珠粒的数量。在一个优选的实施 方案中，至少一部分所述富集珠粒结合多于一个的所述包含扩增模板的乳剂珠粒。实际上， 典型地，富集珠粒结合多个乳剂珠粒（在另一个实施方案中，图10)，即所述包含扩增模板 的乳剂珠粒。
[0020] -旦乳剂珠粒被俘获在富集珠粒上且缺乏扩增模板的乳剂珠粒被分离，则在一些 实施方案中，有用的是使所述俘获的乳剂珠粒与所述富集珠粒分离。这可以以许多方式进 行。在一个实施方案中，通过离心使所述包含扩增模板的乳剂珠粒与所述富集珠粒分离。
[0021] 并不打算将本发明限于乳剂隔室中的特定的PCR试剂。在一个实施方案中，所述 PCR试剂包含核苷酸或核苷酸类似物和缓冲液中的聚合酶。
[0022] 本发明关注多种模板源。在一个实施方案中，所述模板包含剪切的DNA片段（例 如片段化的基因组DNA)。在一个实施方案中，所述剪切的DNA片段包含3'和5'衔接子。 在该实施方案中，所述第一种和第二种引物与部分所述衔接子之一互补。或者，使用对剪切 DNA片段区具有特异性的引物。在另一个实施方案中，使用随机引物。
[0023] 并不打算将本发明限于所用引物的长度。尽管可以使用8-100个（或更多的）核 苷酸长度，但是便利地使用20-30个之间长度核苷酸的引物。
[0024] 在该方法中，可以通过多种方式促进分离步骤。例如，在一个实施方案中，所述乳 剂珠粒是磁性的，且使与所述富集珠粒分离的所述乳剂珠粒暴露于磁体。这可以允许便利 的分离和集中分离的乳剂珠粒。
[0025] 在另一个实施方案中，本发明关注富集方法，其包括：a)提供：i)包含多个油中的 水性隔室的乳剂，所述多个隔室的一部分包含乳剂珠粒、PCR试剂、固定在乳剂珠粒上的正 向引物、溶液中的生物素化反向引物、以及模板；和ii)富集珠粒，所述富集珠粒包含链霉 抗生物素蛋白且大于所述乳剂珠粒；b)使所述乳剂暴露于这样的条件，以便在所述隔室中 的所述乳剂珠粒的至少一些上扩增至少一些所述模板，所述扩增模板包含在两链双链体的 一条链上的生物素；c)破裂所述乳剂，以使所述乳剂珠粒从所述隔室中游离；d)通过与所 述富集珠粒接触来富集从所述隔室中游离的所述乳剂珠粒中包含扩增模板的乳剂珠粒，其 中大部分包含扩增模板的乳剂珠粒结合至所述富集珠粒，以构成生物素-链霉抗生物素蛋 白珠粒复合物，且大部分不含扩增模板的乳剂珠粒保持未结合；e)在使得未结合的乳剂珠 粒通过所述过滤器的条件下将所述珠粒复合物俘获在过滤器上；f)使所述珠粒复合物经 历这样的条件，以便使所述包含扩增模板的乳剂珠粒与所述富集珠粒分离。
[0026] 此外，本发明不限于用于扩增的任何特定条件。在一个实施方案中，所述暴露于步 骤b)的条件包括温度循环。
[0027] 如上所述，分离可以以众多方式促进分离。在一个实施方案中，所述隔室中的所述 乳剂珠粒是磁性的，且在步骤c)之后回收所述磁性珠粒，且此后，暴露于磁体，并且洗涤。 这有利于从乳剂中分离乳剂珠粒并且允许多个洗涤步骤（如果需要），以除去任何残留的 油和/或未反应的试剂。
[0028] 可以以多种方式从所述富集珠粒中释放和分离作为复合物的组成部分的所述乳 剂珠粒。在一个实施方案中，所述步骤f)的条件包括变性条件。可以以众多方式促进这种 分离。在一个实