in，4 °C终止反应。
[0020] 4、第二轮PCR扩增完毕后，PCR产物用1%琼脂糖凝胶分离检测并回收目标片段，与 干涉载体pHellsgate2的质粒进行交换重组反应（BP反应)。重组反应体系：5 μL BP缓冲 液，100 ngPCR产物，100 ng pHellsgate2 质粒 DNA，4 μL BP Clonase，25°C反应 12 h，然后 加入蛋白酶K，37°C 10 min终止反应。所用的试剂为Gateway? BR Clonase ? II enzyme mix贝勾自 Invitrogen公司。
[0021] 5、连接产物通过热击转化法转入大肠杆菌DH5a，利用特异引物（attBl- attB2- 对阳性克隆进行PCR检测。提取阳性重组子质粒，电击法转化农杆菌 GV1301。在含Rif 50 mg/L、Spe 100 mg/L的LB平板上筛选阳性克隆，并对所选单菌落进 行PCR验证（图1)。
[0022] 实施例3.转基因烟草的制备 1、无菌苗制备 1)取适当数量的K326种子置于I. 5 mL离心管中，加入I mL 70%乙醇，消毒30s或直 接翻转振荡数次即可。待沉降，吸去乙醇。
[0023] 2)加入含2-2. 5%有效氯的NaClO产品I mL颠倒振荡6-7 min，吸去NaClO溶液。
[0024] 3)用无菌水清洗至少5次左右，每次翻转振荡约I min，需将漂白水完全洗净，避 免影响种子萌发率。吸去无菌水。
[0025] 4)消毒剪刀，将无菌黄色枪头前端剪成楔形（或剪成楔形后高压灭菌），用枪头取 种子播种于MS固体培养基上。
[0026] 5)用封口膜封口，28° C光照培养3天左右可发芽。勤观察，若有小范围污染，可 用手术刀切去；若有大片真菌污染，则应废弃。
[0027] 2、叶盘法转化 1) 将待用的手术刀片、镊子在酒精灯上彻底烧过三次以上，用于切割叶片； 2) 去掉叶片边缘部分和主脉部分，一般一片叶子可切成四个外植体； 3) 每换一个叶片，均要烧一下镊子和刀片以免污染； 4) 将切好的外植体放入灭菌平皿中，倒入预先准备好的农杆菌菌液（已经转入目标质 粒？他1188&七62-财?031)(00600=0.6-0.8)，此过程应尽量在超净台靠近出风口处操作，以 免农杆菌飘散到超净台里面。
[0028] 5)用镊子将每个外植体浸润到菌液，盖上平皿盖侵染10 min ; 6)镊子夹取外植体到无菌滤纸上吸掉叶片表面过量的农杆菌，之后移入表面覆有一层 滤纸的共培养培养基上； 7)用封口膜封上放入黑暗条件进行暗培养48 h。
[0029] 3、分化培养 1) 暗培养后，将外植体移入分化筛选培养基中； 2) 之后每隔7天左右换一次培养基以保证养分供应。在皿间转移外植体过程中，在超 净台打开平皿之前，应仔细观察有无菌类污染，如有污染，应该先转移没有污染的平皿； 3 )每换一个共培养平皿，均要彻底烧一次镊子以免皿间菌污染。
[0030] 注意：如培养基有菌污染，当培养基中出现真菌，应弃掉，不能在组培室中打开平 皿以免真菌孢子扩散。当出现农杆菌，应将超净台风力调到最小，在超净台风口附近操作， 且打开有细菌的平皿的时间要尽量的短，平皿的开口不能超过皿大小的一半，来减少菌扩 散到空气中的几率。这些操作宜快速完成。
[0031] 4、生根培养 1)待分化培养的外植体分化出I cm高的小苗时，用烧过的刀片切下分化出的小苗（尽 量不要切到愈伤组织，但也不能把两片子叶间的叶芽生长点破坏）移入1/3 MS生根培养基 中。
[0032] 2)每切一块外植体，都要烧一次刀片和镊子，且种入培养基中的小苗不宜插入培 养基中太深，小苗基部插入培养基固定即可，同时镊子不要在培养基上停太长时间以免污 染。
[0033] 5、炼苗和移栽 1)培养一个月左右生根长达2 cm时，将组培瓶的口敞开，加入适量的水，温室中放置1 -2天进行炼苗（也可以直接移栽入土）。
[0034] 2)将苗子从组培瓶中取出来，小心并彻底清除苗子根部的固体培养基（用水彻底 洗干净），而后移入花盆中，上面用保鲜膜覆盖2-3天（保湿），待苗子生长正常后，移去保 鲜膜。
[0035] 6、设置对照株K326,待转基因苗生长至6-8片叶时，选取长势一致的植株进行基 因 NtPCSl表达检测。如图2所示：和对照比，NtPCSl的表达量下降90%左右，沉默效果良 好。
[0036] 7、选取表达量下降明显的沉默株，和对照进行水培镉处理实验。1 μ mol/ L镉离子浓度处理24小时，ICP-MS法检测叶片镉含量，如图3。和对照植株比，沉默株叶片 中镉含量明显降低，下降60%-70%。
[0037] 本发明实验结果表明：通过基因干扰的方法，降低的表达，新鲜烟叶中的 锦含量显著降低。
【主权项】
1. 一种烟草植物螯合肽合成酶蛋白基因，其特征在于：所述基因核苷酸序列如SEQID NO. 1所示，该基因编码的氨基酸序列如SEQIDNO. 2所示。2. -种烟草植物螯合肽合成酶蛋白基因的应用，其特征在于：以所述烟草植物螯合肽 合成酶蛋白基因的特异性核苷酸片段，通过重组反应导入到植物表达载体中，构建烟草植 物螯合肽合成酶基因的RNAi干扰载体并转化烟草植株，获得低镉的转基因烟草植株。3. 如权利要求2所述的烟草植物螯合肽合成酶蛋白基因的应用，其特征在于：所述基 因特异性核苷酸片段如SEQIDNO3所示。4. 如权利要求2所述的烟草植物螯合肽合成酶蛋白基因的应用，其特征在于：所述干 扰载体的特异引物为： attBl如SEQIDNO. 4 所示； attB2 如SEQIDNO. 5 所示； attBl-yVi/^57如SEQIDNO. 6 所示； attB2- 如SEQIDNO. 7 所示。5. 如权利要求2所述的烟草植物螯合肽合成酶蛋白基因的应用，其特征在于：所述干 扰载体的特异性干扰片段如SEQIDNO. 3,大小为403bp。6. 如权利要求2所述的烟草植物螯合肽合成酶蛋白基因的应用，其特征在于：所述干 扰载体的中间表达载体为pHellsgate2。7. 如权利要求2所述的烟草植物螯合肽合成酶蛋白基因的应用，其特征在于：所述干 扰载体是通过农杆菌介导的叶盘转化法转入烟草植株。
【专利摘要】本发明涉及一种烟草植物螯合肽合成酶基因及其应用，属于生物技术领域，具体涉及烟草镉吸收和分布的关键基因及其在烟草降焦减害领域的应用。本发明利用基因沉默技术构建了<i>NtPCS1</i>基因的干扰载体，成功获得了<i>NtPCS1</i>的K326沉默植株，所获得的沉默植株拥有镉含量相对对照植株明显降低的表型。可见，利用基因沉默技术降低<i>NtPCS1</i>基因的表达能够获得镉含量降低的转基因植株，使得低镉烟草育种成为可能，为降低烟草镉含量提供了一种有效的技术手段。
【IPC分类】A01H5/00, C12N15/54, C12N15/82, C12N9/10
【公开号】CN105385701
【申请号】CN201510989403
【发明人】翟妞, 周会娜, 陈千思, 陈霞, 刘萍萍, 郑庆霞, 徐国云, 金立锋, 张慧, 高玉龙, 王晨
【申请人】中国烟草总公司郑州烟草研究院
【公开日】2016年3月9日
【申请日】2015年12月24日