一种烟草植物螯合肽合成酶基因及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及烟草镉吸收和分布的关键基因及其在烟草降 焦减害领域的应用。
【背景技术】
[0002] 香烟中重金属的含量愈来愈受到国内外烟草工业的极大关注。尤其是重金属镉， 因其毒性大、污染普遍、烟草容易富集、容易向卷烟烟气迀移而受到格外关注，是FCTC优先 披露的18种有害成分之一，已成为国内外烟草减害的目标物之一。因此，多年来烟叶锦控 制的研究一直是国内外烟草重金属研究和控制的主攻方向和研究热点。我国镉污染耕地约 占全国污染耕地的40%左右，与20世纪90年代相比，我国植烟土壤重金属元素呈现出不同 程度富集特征，镉的富集尤其明显。同时，我国相当部分优质烟叶产区位于土壤镉的高背景 地区云贵高原，造成部分优质烟叶样品镉含量较高。因此，有效降低我国烟叶镉含量以提高 烟草制品安全性的问题尤为突出。
[0003] Cd2+的吸收主要是通过一些对Cd2+具有低亲和性的多底物金属离子转运蛋白或通 道蛋白进入植物细胞内。重金属被配体络合而后转运至液泡中进行储存是植物缓解重金属 毒害的途径之一。在这一过程中，镉的细胞络合发挥着重要作用。在植物细胞内参与重金 属超富集相关的配体主要有金属硫蛋白（MTs)和植物螯合肽（PCs)。所以通过调控烟草植 物螯合肽合成酶在烟草中的表达，降低烟草成熟叶片中镉含量是卷烟降焦减害的 有效途径之一。
[0004] RNA干扰（RNA interference，RNAi)是一项常规的分子生物学技术，是外源或者内 源的双链RNA在生物体内同源诱导靶基因 mRNA的特异性降解，从而导致转录后基因沉默。 RNAi技术在植物研究中的应用，在植物功能基因分析、抗逆性、抗病虫害和遗传改良等方面 有重大作用。本发明通过RNAi技术降低NtPCSl在烟草中的表达，从而降低烟草叶片中镉 含量，为烟草品种改良提供技术支撑。
【发明内容】
[0005] 本发明提供了一种调控烟草镉吸收和分布的关键基因及其在烟草降焦减害领域 的应用，并公开了该基因的沉默植株的构建方法。
[0006] 为实现上述目的，本发明采用以下技术方案： 一种烟草植物螯合肽合成酶蛋白基因，其特征在于：所述基因核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，该基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
[0007] -种烟草植物螯合肽合成酶蛋白基因的应用，其特征在于：以所述烟草植物螯合 肽合成酶蛋白基因的特异性核苷酸片段作为引导序列，将该特异性核酸片段以正反两个方 向插入到植物表达载体中，构建烟草植物螯合肽合成酶基因的RNAi干扰载体并转化烟草 植株，获得低镉的转基因烟草植株。
[0008] 所述基因特异性核苷酸片段如SEQ ID NO 3所述，大小为403bp。
[0009] 所述干扰载体的特异引物为： attBl 如 SEQ ID NO. 4 所示； attB2 如 SEQ ID NO. 5 所示； attBl-yVi/^57如 SEQ ID Nd 6 所示； attB2- yVi/^57如 SEQ ID NO. 7 所示。
[0010] 所述干扰载体的中间表达载体为pHellsgate2。
[0011] 所述干扰载体是通过农杆菌介导的叶盘转化法转入烟草植株。
[0012] 本发明的有益效果是：通过基因沉默技术构建了 NtPCSl基因的干扰载体，成功获 得了 NtPCSl的K326沉默植株，所获得的沉默植株拥有镉含量相对对照植株明显降低的表 型。可见，利用基因沉默技术降低NtPCSl基因的表达能够获得镉含量降低的转基因植株， 使得低镉烟草育种成为可能，为降低烟草镉含量提供了一种有效的技术手段。
【附图说明】
[0013] 图 1 为阳性克隆 PCR，其中 M :marker DL2000 ;1-3 :pHellsgate2-NtPCSl 克隆； 图2为基因干扰株系中NtPCSl的相对表达量； 图3为对照和基因干扰株系叶片中镉含量。
【具体实施方式】
[0014] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，这些实施例仅用于说明本发明而不用 于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件。
[0015] 实施例1.烟草植物螯合肽合成酶基因全长的克隆 本发明的烟草植物螯合肽合成酶基因 NtPCSl可以是CDNA序列，也可以是基因组DNA 序列，或者是与这些序列具有90%以上同源性且编码相同功能蛋白的DNA序列。例如序列 表中SEQ ID NO :2所示的DNA序列。
[0016] 通过同源克隆的方法，根据高等植物中的植物螯合肽合成酶序列，以K326叶片的 总RNA反转录的cDNA为模板，设计引物克隆了 的ORF全长1272如序列（SEQ ID NO : 2)，其编码的蛋白序列如序列表中的SEQ ID NO :1所不，序列结果分析表明，该蛋白含有同 源性很高，高度保守。
[0017] 实施例 2.干扰载体 pHellsgate2-yVi/^57 (PCSli)的构建 1、根据载体类型及BP重组反应的要求，设计两对PCR引物，一对是基于重组位点attBl (GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCA GGCT)和 attB2 (GGGGACCACTTT GTACAAGAAAGCTGGGT)的通用引物；另外一对则在重 组位点attB序列后加上基因的部分序列设计而成，引物序列为attBl- - AAAAAGCAGGCTC4 CTTTGTACAAGAA AGCTGGGT, attB2- NtPCSl- AGAAAGCTGG GT CCGGTA TGA TCCGGTA CGAAAA 〇
[0018] 2、首先以 attBl- yVi/^57/attB2- 进行第一轮 PCR 扩增，PCR 反应体系为： 1 μ I cDNA 为模板，5 μ I IOXPyrobest DNA polymerase buffer，5 μ I dNTPs( 2 mmol / L),0. 2 μ I att^l-NtPCSI primer (10 ymol/L),0. 2 μ I attB2- NtPCSl primer (10 μ mol/L)，0.25 μ 1 高保真 Pyrobest DNA polymerase (Takara，Japan)，加 ddH20 至 50 μl终体积。PCR反应程序：94°C，2min;94°C，30s，58°C，45s，72°C，30s，10个循环 ； 72 °C，5 min，4 °C 终止反应。
[0019] 3、取PCR产物为模板，以attBl/attB2引物进行第二轮扩增，PCR反应体系为：5 μL 第一步 PCR 产物为模板，5 μ 1 10 XPyrobest DNA polymerase buffer，4 μ I dNTPs (2 mmol/L),4 μ I attBl primer (10 μmol/L),4 μ I attB2 primer (10 μmol/L),0. 25 U 1 高保真 Pyrobest DNA polymerase (Takara，Japan)，加 ddH20 至 50 μ 1 终体积。PCR 程序：94 °C变性 2 min;94 °C，30 s，45 °C，30 s，72 °C，30 s，5 个循环；94 °C，30 s，58 °C，30 s，72 °C，30 s，5 个循环；72 °C，8 m